西安交大最新綜述：第三代PCR技術

　　自1985年 Mullis 發明了體外多聚酶鏈反應(PCR)至今, PCR在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領域和法醫鑒定等方面發揮了巨大作用.今天的第三代PCR技術, 即絕對定量的數字化 PCR也備受關注。來自西安交通大學生命科學與技術學院等處的研究人員近期發表綜述，介紹了 PCR 技術的發展歷程, 綜述和討論了絕對定量的數字化 PCR 的技術路線和應用進展, 總結提出了其進一步發展面臨的問題, 并展望了數字 PCR 技術在生物醫學方面的發展前景.

　　第一代 PCR(即終點法 PCR)在進行擴增后只能獲得半定量的結果. 隨著生物分子熒光技術的發展, 1992 年, 實時定量 PCR(RT-PCR)即基于熒光探針或染料的第二代 PCR 技術應運而生.該技術隨后逐漸發展為檢測目標片段的主流分子生物學技術. 在實時定量 PCR 過程中, 熒光信號隨著擴增產物的積累而增強. 實時熒光定量 PCR 能夠實時獲得模板擴增的熒光值, 然后根據 DNA 模板在指數增長時期的 Ct 值與標準 DNA 的 Ct 值比較來計算初始模板的濃度. 但是這種方法由于是大體積反應系統, 非特異性的擴增增加了假陽性結果和背景信號, 因此, 最終無法獲得絕對定量的結果(“絕對定量”指的是目標分子的數量).

　　如今, PCR 技術為了達到絕對定量化已經發展到了第三代, 即數字 PCR(digital PCR), 相比較于第一代和第二代 PCR技術, 微量的樣品就足以獲得可靠的檢測結果. 其中的“數字”被解釋為單一實體中信號的開關(如開或關,凝固的或非凝固的, 激活的或非激活的, 熒光的或非熒光的, 有差別的和無差別的).

　　數字 PCR 是在有限稀釋條件下將單個待檢測的 DNA 模板分散于單個重復的反應體系中, 每個反應體系中有一個 DNA 模板沒有 DNA 模板(統計上), 這樣極大減少了擴增后DNA 模板檢測的背景熒光[10]. 數字 PCR 具有顯著提升檢測通量, 極大提高檢測精確性, 提升檢測濃度下限的優勢.

　　在數字 PCR 中, DNA 模板擴增前被稀釋到一定的濃度, 在此濃度下, 包含單個 DNA 模板的微體系通過擴增被熒光探針檢測到并產生某種顏色熒光的特定信號, 而不包含單個 DNA 模板的微反應體系則不能產生熒光信號. 因此, 通過計算產生陽性信號的微反應體系數量就能提供一個準確的數字化結果.通過此方法, 樣品中的初始目標 DNA 模板就能夠被絕對定量, 這樣極大降低了 PCR 產生的擴增偏倚(即非特異性的擴增). 隨著 PCR 相關技術的飛速發展,現在可以利用微納技術實現數字 PCR 實驗的特殊需求. 然而由于該技術尚處于發展階段, 存在技術缺陷導致的假陽性、昂貴的實驗成本、復雜的實驗過程、臨床研究缺乏等丞待解決的挑戰. 所以對這一新興領域做一個全面的概述是非常必要的.

　　近期, 越來越多的人開始關注數字 PCR, 科學引文索引收錄的相關文章的數量也在飛速增長. 該領域綜述性文章主要涉及數字 PCR 發展史以及相關應用, 極少涉及該領域技術路線的分類和對比, 以及不同技術路線催生的產品和應用范圍. 毋庸置疑, 作為一種絕對定量的分子生物學研究工具, 數字 PCR將在 DNA的定量檢測中承擔越來越重要的角色.

　　這篇文章首先按照不同樣品分散方法對數字 PCR 的技術路線做了清晰的劃分, 同時介紹了不同技術路線中的新興技術, 最后展示了目前數字 PCR 的相關應用. 其中, 尤其對數字 PCR 的關鍵技術路線及其發展水平進行了介紹, 包括樣品的分散, 信號放大(即多聚酶鏈式反應), 熒光圖像的獲取和處理, 并進一步概述了新興的可與數字 PCR 整合的微納技術.

　　作者指出，因為其獨一無二的檢測精確性, 數字PCR 在生物醫學領域中具有廣泛的應用. 然而, 具有高通量、微體系、高靈敏度的數字 PCR 技術在進一步發展中仍受制于一些因素. 尚需解決以下問題:

　　(ⅰ) 如何不借助儀器, 在微孔板或者微流控芯片上進行簡單、穩定且高效的液體(液滴)操縱, 以產生單分子的 PCR體系；

　　(ⅱ) PCR熱循環和液體操縱過程中微體系之間的良好獨立性如何實現；

　　(ⅲ) 如何能在不影響數據質量和檢測速度的同時做到檢測系統小型化；

　　(ⅳ) 借助微體系分割, 數字 PCR檢測到的樣品濃度極限能夠達到什么數量級.

　　隨著微納加工、熒光成像、微流控等領域的快速發展, 在高精度、短時間核酸檢測需求的推動下, 數字 PCR 領域面臨的問題將會被一一解決, 從而實現分子診斷領域的跨越式發展. 數字 PCR 是一項非常有前景的 DNA 定量檢測技術, 然而目前依然處于實驗研究階段. 雖然市場上已經存在商品化的數字PCR 平臺, 但這些產品大多價格昂貴且功能集成化程度較低, 同時對于多目標物的檢測能力較弱. 這些方面也限制著數字 PCR 技術的應用與普及, 同時也正是該領域的研究者應該去解決的問題. 期待在不久的未來, 整個數字 PCR 檢測系統在交叉領域發展的推動下, 可以實現結構的極大簡化, 功能的高度集成以及成本的最大削減, 并被應用于生物醫學檢測的最前沿領域, 最終走進人們的日常生活.