見所未見：OptiMS拓展您的質譜潛能

　　——貝克曼庫爾特公司在2011大連色譜會推出CESI 8000

　　【導語】在各種omics、系統生物學成為尋找新一代治療藥物的基本研究思路后，質譜被推上了歷史的舞臺。在這類研究中，以納升/分鐘（nL/min）的流速和質譜高效地聯用是關鍵。若干年前，CE-MS被nanoLC-MS技術拋在了后面，因為CE鞘液的稀釋導致其連接的質譜屈尊降到了讓人難以接受的、紫外的靈敏度。作為毛細管電泳技術的先驅，貝克曼庫爾特臥薪嘗膽、歷經5年推出了無需鞘液的OptiMS技術，今日在大連色譜會上隆重推出了應用OptiMS的CESI 8000毛細管電泳，并列舉了在CE-MS聯用上，令人難以置信的1000倍以上的靈敏度提升、蛋白鑒定的高覆蓋率、鑒定翻譯后修飾的超高能力。

　　接下來，小編帶您一起來了解這些科學家的工作吧；他們的工作，是最好的證明！

　　2011年10月10日，貝克曼庫爾特公司無鞘液毛細管電泳質譜聯用系統CESI 8000產品發布會在大連世界博覽廣場第五會議室隆重召開。來自國內外色譜、質譜等分離分析領域的100余專家學者們參加了此次發布會。來自奧地利Innsbruck醫學院生物中心臨床生物化學部的Herbert Lindner教授做了精彩的報告，詳細比較了貝克曼新型CESI-MS和nanoLC-ESI-MS在鑒定多肽方面的性能。Lindner的同事Bettina Sarg博士介紹了用新型CESI-MS分析鑒定蛋白翻譯后修飾位點的成果。

發布會現場

新型CESI 8000毛細管電泳

技術回顧：無鞘液的OptiMS

　　作為毛細管電泳技術的先驅，貝克曼庫爾特公司潛心5年研發了新型的CESI 8000毛細管電泳儀，特別適用于蛋白質組學研究中的CE-MS分離分析。它采用無鞘液式CE-MS聯接技術，將分離毛細管的出口部分腐蝕成多孔材料，多孔材料的外面由導電液體所包裹，導電液體與毛細管出口處的電極接觸，為毛細管電泳的正常分離提供電壓，也同時提供質譜離子化電壓的加載。 由于該項技術的采用，使得CE-MS靈敏度提高1000倍以上，并超過現有LC-MS靈敏度1-2個數量級，是目前靈敏度最高的CE-MS系統。同時此項創新技術能夠很好地解決LC-MS技術對高極性物質分離效果不佳的問題。

傳統鞘液設計的CE-MS接口

新型OptiMS接口

更多閱讀：五年研發結晶 最優化的毛細管電泳-質譜聯用系統　　

CESI-MS vs nanoLC-MS技術：鑒定組學中的多肽

奧地利Innsbruck醫學院生物中心臨床生物化學部的Herbert Lindner教授

　　題目：CESI-MS，a New Technology for the Identification of Peptides: Comparison with nanoLC-ESI-MS

Linder教授報告

　　Lindner教授介紹了CE-MS用于蛋白質組學研究的挑戰。相比基于色譜柱分離的nanoLC-MS技術，CE-MS有以下優點：（1）更高的效率；（2）更低的流速，可能具有更高的靈敏度；（3）沒有梯度效應；（4）不需要柱平衡時間，即分析時間可能更短；（5）較少的交叉污染（carryover），即不需要考慮洗針，分析時間可能更短；（6）和HPLC有不同的分離機理，依賴于電荷而不是憎水性；（7）使用和HPLC不同的儀器系統，不需要換泵。同時，CE-MS潛在會有以下缺點：（1）載樣量有限；（2）涂層的穩定性；（3）需考慮涂層和分析物的反應；（4）堵塞。

　　所以，CE-MS系統的耐用性（robustness）非常重要。

　　Lindner教授介紹了自己在前幾年用毛細管區帶電泳（CZE）對大鼠睪丸的天然H1組蛋白（histone）進行分析的結果。

　　接下來，他主要對比了新型CE-MS和LC-MS的結果。使用的樣品包括：血管緊張素Angiotensin1和2的多肽標準品；大鼠睪丸連接器組蛋白（Rat Testis Linker Histones）；人類腫瘤細胞中的連接器組蛋白；過乙酰化核心組蛋白（Hyperacetylated Core Histones），用Arg-C酶解，比較新型CE-MS和LC-MS的結果（LC-MS采用nanoLC）。

OptiMS Silica Surface Capillary Cartridge

　　首先，用甲酸作BGE分析了血管緊張素Angiotensin 1和2的多肽標準品，條件為：樣品濃度75fmol/uL，樣品總量300amol，進樣4uL，BGE為0.1％甲酸pH2.7，涂層為polyethyleneimine silane，E=250V/cm，ESI電壓為1.7kV。結果的靈敏度S/N分別為：Ang-1 ：203，Ang-2：94。然后其余條件不變，改變進樣量為0.18~0.75 nL，即樣品總量為14~57 amol，在最低的0.18nL進樣量下，提取離子流圖（XIC）仍可獲得很好的靈敏度，Ang-1：13.9 amol, S/N=84.8，Ang-2：17.2 amol，S/N=34.3。

　　然后，在比較了多種毛細管涂層后，選擇了M7C4l。其中CE-MS的實驗條件為：進樣7.7nL，樣品總量為300fmol， BGE為0.1％甲酸pH2.7，涂層為M7C4l，E=250V/cm，ESI電壓為1.7kV。

　　比較CESI-MS（300fmol樣品）、LC-MS（300fmol）、LC-MS（3.0 pmol）水平的樣品檢測結果，CESI-MS的出峰時間較快，12.83min即出完，而nanoLC-MS需要46.03min，但CE-MS的分辨率卻非常好。從鑒定的多肽數目來看，CE-MS鑒定了135個H1組蛋白肽，48個非組蛋白肽，而LC-MS（300fmol）的相應兩個數字是：79個/30個，LC-MS（3.0 pmol）為129個/74個，可看到CE-MS的靈敏度明顯高（基本相當于3.0 pmol的LC-MS結果，即靈敏度比LC-MS高10倍）。在對7種組蛋白的鑒定序列覆蓋率的比較中，也看出CE-MS的結果要明顯優于LC-MS。

三種不同條件下的CE-和LC-MS分析

　　從H1組蛋白肽的鑒定上來看，CE-MS（300fmol）比較LC-MS（3pmol），兩者共同鑒定的是78個，僅有CE-MS鑒定的是57個，僅有LC-MS鑒定的是51個。事實說明，CE-MS不僅提高了靈敏度，而且成為LC-MS鑒定的有力補充，使用兩種技術后，鑒定的數目從129個增加到了186個（51＋78＋57）。

　　

被鑒定出的肽（300 fmol CE-ESI-MS和3.0 pmol LC-ESI-MS）

,

　　接下來，Lindner教授考察了對修飾后的肽的鑒定。 其中LC-MS條件為：進樣770 nL，樣品總量為300 pmol。CE-MS的實驗條件為：進樣7.7nL，樣品總量為300 fmol， BGE為0.1％甲酸pH2.7，涂層為M7C4l，分離電壓為25kV，E=267V/cm，ESI電壓為1.7kV。同樣可看到CE- MS（300fmol）的鑒定數目幾乎相當于LC-MS（30pmol）的，即靈敏度比LC-MS高接近100倍；在修飾鑒定的種類上，CE-MS會少一 些。

兩種技術對比：鑒定翻譯后修飾的多肽

      Lindner教授認為，CE-MS的分離時間很短，囿于質譜的采集速度，要想獲得更多的鑒定結果，需要拓寬分離的窗口，即降低EOF。這時可采用：使用 較少正電荷的涂層，減低分離電壓，提高離子強度等方法。Lindner教授比較了幾種結果，CE-MS（M7C4l涂層，12.5kV分離電壓）獲得了非常好的結果。

兩種技術對比：鑒定翻譯后修飾的多肽

用CESI-MS和LC-MS，共計發現了56個翻譯后修飾的多肽，實驗條件為：

CESI-MS，進樣7.7 nL，樣品量300 fmol，毛細管涂層為M7C4l，分離電壓為12.5 kV，3次總運行時間為1.9小時（115 min）

LC-ESI-MS，進樣770 nL，樣品量30 pmol，3次總運行時間為4.1小時（246 min）

總結：翻譯后修飾的鑒定

　　最后，對比貝克曼新型CE-MS和傳統nanoLC-MS技術，Lindner教授給予了總結，

　　（1）在同樣的樣品量下，CE-MS有更高的靈敏度、更高的序列覆蓋率；

　　（2）使用CE-MS，可提高低分子量肽（800－1200 Da）的檢出；

　　（3）CE-MS技術一般可縮短分析時間，該時間可通過使用不同的毛細管涂層、分離電壓和緩沖液來調節；

　　（4）CE-MS非常適用于分析翻譯后修飾的多肽；

　　（5）CE-MS具有非常明顯的一個優勢是——極低的交叉污染；

　　（6）這是一個耐用性（robustness）很好的技術。

　　（7）CESI-MS和LC-ESI-MS技術是互補的。

,

鑒定翻譯后修飾的位點

　　奧地利Innsbruck醫學院生物中心臨床生物化學部的Bettina Sarg博士

　　題目：Application of CESI-MS for the Analysis of Site-specific Protein Modifications

　 　Bettina Sarg博士進一步介紹了用新型CESI-MS，在翻譯后修飾鑒定方面的結果。Sarg博士首先介紹了翻譯后修飾的作用。翻譯后修飾會改變蛋白的物理化學 性質，比如折疊、穩定性、活性和功能等。對于組蛋白的研究發現，有一些壓制性的修飾和一些活性的修飾，這些跟DNA結合的蛋白（如轉錄因子）有關。隨 后，Sarg博士進行了翻譯后修飾的實驗，樣品包括：來源于腫瘤細胞的過乙酰化（Hyperacetylated）的組蛋白H4，大鼠睪丸核心組蛋白，大 鼠睪丸連接器組蛋白，火雞雞胗的鈣調結合蛋白（Turkey Gizzard Caldesmon）。比較的儀器為：（1）CESI-MS：PA800plus-LTQ-Orbitrap XL（目前的CESI 8000是PA800plus的升級新產品）；（2）nanoLC-ESI-MS：Ultimate3000 -LTQ-Orbitrap XL。

　 　在對來源于腫瘤細胞的過乙酰化（Hyperacetylated）的組蛋白H4的分析中，用CESI-MS分析了天然蛋白，操作條件為：毛細管 30um ID, 88-100 cm，正電荷涂層M7C4l，BGE用0.1%甲酸，導電液體為0.1%甲酸，分離電壓為25kV，噴霧電壓為1.55kV，毛細管溫度為25℃，分離電 流為1.3 uA。

　　對大鼠睪丸核心組蛋白，用CESI-MS分析翻譯后修飾的多肽。實驗用CESI-MS鑒定了H2A和H2B翻譯后修飾的位點，并均具有高的序列覆蓋率（H2A為90.0%，H2B為88.9%）。

　 　Sarg博士還使用了IMAC磷酸化蛋白富集技術，對比使用CESI-MS和LC-MS的結果，其中CESI-MS的實驗條件為，進樣量8.5 nL，BGE用0.1%甲酸pH2.7，毛細管涂層用M7C4l，E=250 V/cm，ESI噴霧電壓為1.7 kV。隨后又把分離電壓從25 kV改變到12.5 kV，可以鑒定出更多的磷酸化肽。使用IMAC磷酸化富集技術后，用CESI-MS和LC-ESI-MS共同鑒定的磷酸化肽為14個，僅用CESI-MS 鑒定出的有23個，僅用LC-ESI-MS鑒定出的為18個，兩種技術共鑒定出55個。

CE-MS和LC-MS鑒定翻譯后修飾位點的對比，CE-MS更容易鑒定小分子量的多肽

磷酸化肽的鑒定結果

　 　在對火雞雞胗的鈣調結合蛋白（Turkey Gizzard Caldesmon）的分析中，也使用IMAC磷酸化肽富集技術，使用LysC酶解鈣調結合蛋白，用IMAC富集后，分別使用CESI-MS和LC- ESI-MS分離分析。結果表明，CESI-MS的靈敏度大概相當于LC-ESI-MS的40倍。而對于7個鑒定的磷酸化位點，當使用同樣的進樣量 時，CESI-MS和LC-ESI-MS同時可鑒定出第1、3種，CESI-MS單獨鑒定出第4、5、6種，而LC-ESI-MS沒有單獨鑒定出的位點； 當使用40倍上樣量后，LC-ESI-MS可單獨鑒定出第2種，兩種技術可同時鑒定出第1、3、5、6種，CESI-MS可單獨鑒定出第4種。

火雞雞胗的鈣調結合蛋白（Turkey Gizzard Caldesmon）的分析中，磷酸化肽鑒定結果對比

　 　總結來看，CESI技術非常適于分析翻譯后修飾（PTM）的多肽，并對PTM具有快速篩查的能力，對于分子量較小的肽來說，CESI技術提高了回收率， 因為這類小肽在反相柱上難以保留，利用CESI-MS技術，實驗鑒定了組蛋白H2A和鈣調結合蛋白的修飾位點，利用IMAC技術富集后，可更好地檢測磷酸 化肽。

       發布會當日座無虛席，聽眾還咨詢了Lindner教授問題。Beckman公司會后進行了抽獎活動。

OptiMS技術：優化您的質譜性能

      新型無鞘液的CESI-MS技術，對所有關注組學的研究者來說，是nanoLC-MS技術的有力補充：靈敏度高；發揮了低流速的優勢、減少了離子抑制；可 鑒定更多小分子量的多肽。除舉例的多肽混合物分析，該技術還非常適用于天然蛋白、代謝組學、藥物和代謝產物等分析。

OptiMS可更換的組件：一套

      新發布的CESI 8000，其CE-MS接口是成套的、可更換的裝置，據公司稱可使用數百次。根據多個質譜廠家，公司提供不同的接口，這些廠家包括：AB SCIEX、Thermo Scientific、Bruker Daltonics和Waters。

      更多應用，小編也和讀者一樣，期待這種新技術能真正讓Beckman重回組學市場，來個咸魚大翻身！......