熒光實時定量 PCR 技術 (real-time quantitative PCR，qPCR) 幾乎是現代分子生物學技術中最重要、應用最廣泛的核酸定量檢測技術。成功的定量 PCR 實驗離不開精準的實驗設計和操作流程。
實時熒光定量 PCR 分析的部分實施需要經過優化以確保所有反應參數均設置精確，從而獲得準確的結果。常見熒光定量 PCR 困難包括引物、探針、反應抑制和軟件分析等幾個方面，本篇主要為大家分享引物和PCR探針方面的經驗。
引物二聚體的形成是最常見的問題之一。引物對之間的部分序列存在同源性時，可形成引物二聚體。如果在 PCR 反應過程中引物退火形成二聚體，則 Taq DNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長于原始引物的產物，它可導致循環過程中更易出現退火錯誤。
Q：引物二聚體會引發什么問題？
引物二聚體對反應的影響在很大程度上取決于反應中采用的化學物質。基于熒光探針的反應受引物二聚體的影響不是很大，這是由于在引物二聚體區域極少出現探針退火及斷裂的現象。此時，引物的競爭作用是需要考慮的主要問題。基于雙鏈 DNA 結合染料的反應受引物二聚體的影響很大，由于染料的結合方式為非特異性的，由此可導致反應過程中監測到的熒光信號增強。這可相應改變 Ct 值，使結果出現偏差。
Q：怎樣確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位于 100 bp 以下。單獨采用凝膠電泳分析進行驗證的缺點在于，其靈敏度最低僅達到納克級，因此可能無法得出結果。
熔解曲線也是一種顯示引物二聚體的放法。如果擴增具有極好的特異性，則實時熒光定量 PCR 板上每個反應孔的解離曲線將出現一個較窄的單峰。引物二聚體的熒光強度較低，呈較寬的「波形」，顯示其在 70 °C 左右熔解（見圖1.）。
圖 1.中突出顯示了引物二聚體效應
Q：怎樣設計和優化實驗避免出現引物二聚體？
最好在引物設計階段就采取簡單的預防措施，從一開始即避免二聚體的形成。如果出現了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體。
首先是優化熱循環條件，這主要是提高退火溫度。大多數情況下，兩步循環（由 95 °C 變性步驟直接進入 60 °C 退火和延伸步驟）有利于強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為 60 °C。
可降低引物濃度，甚至采用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數情況下，每條引物的理想最終濃度為 200——600 nM，但如有需要，可將濃度降至 60 nM。
鎂的最佳濃度一般約為 3 mM。高于此濃度易形成引物二聚體。
如果未對引物形成二聚體的傾向進行評估，則應補充評估并考慮重新設計（如有需要）。通常情況下，最好使用熱啟動 DNA 聚合酶，并在冰上進行反應。
在理論上，針對同一靶點應同時檢測多個引物組。這實際上可以節省大量時間，因為如果這些引物中的一個能立即發揮作用，則可以減少花費在優化過程上的時間。
引物和探針的儲存
引物和探針儲存不當可導致降解及特異性喪失，進而對反應效率造成影響。影響引物和探針的穩定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否被長時間曝光、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。
Q：如何長期保持引物和探針的穩定性？
保持引物和探針的穩定性的關鍵有四點。低壓凍干的引物在儲存時間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應置于 -20 °C 保存，且若保存時間超過一年則應對其進行監測，看它是否出現功能下降。對于標記的引物和探針，則應采取措施避免標記物曝光（例如使用不透明管及置于暗處保存），以延長它們的使用壽命。
引物濃度也可影響其穩定性。建議引物的儲存濃度不低于 10 μM；實際上，在大多數情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應分裝保存，以減少凍融次數，特別是標記的引物和探針。最后，TE 緩沖液可形成比水更為穩定的環境。此外，含有 0.1 mM EDTA 的 TE 緩沖液（標準 TE 中含有 1 mM EDTA）是一種理想的溶液，這是由于一些 PCR 反應對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。
當引物二聚體形成時，如果使用與 DNA 雙鏈結合的染料，在 NTC 反應中也可觀察到熒光信號。也存在另一種情況，在存在污染物的情況下，無論是基于探針還是雙鏈 DNA 結合染料的反應，引物二聚體的擴增也會在 NTC 孔中被觀察到。這可能是一種隨機事件，并不是所有 NTC 都會出現擴增，通常是由不常見的加樣錯誤引起。如果在每一個 NTC 反應里都出現擴增，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了。
Q：如何防止或去除污染？
使用干凈的工作臺，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作臺面。
用帶 dUTP 和 UDG 的反應預混液降解來自前序 PCR 反應的產物，防止前序 PCR 反應的污染。
用新的反應管盡量通過置換不同來源的試劑，發現出現問題的試劑。
在條件允許的情況下，在不同的實驗地點建立反應，尤其是當應用質粒作為對照時（質粒可以被很容易擴散并且難以去掉）。
實時熒光定量 PCR 分析優化過程確實需要時間，但是所花的時間是值得的。這樣得出的分析結果不僅具有最高的靈敏度和最大的動態范圍，而且準確度高、效率高、重復性好，為實驗提供可靠的數據。