診斷性二代測序指南

   通過二代測序（next-generation sequencing，NGS）能夠快速地對某個個體患者的數千個甚至數百萬個DNA堿基對進行測序。這一技術快速出現并且獲得成功，這預示著一個遺傳學診斷的新的時代的到來。但是，新技術也帶來了新的挑戰，一方面是技術層面上的，即數據處理問題，另一方面是對結果的解釋和后續遺傳咨詢方面的問題，而所有這些都會涉及到對NGS在診斷方面的精確定位問題，無論是今天還是明天都是如此。在著手購置進行診斷性NGS的機器以及有關技術之前尚有許多問題需要處理。基于上述情況，我們提出了這份指南。這些指南最主要的是解決NGS檢測在罕見的和主要的單基因遺傳病方面的問題，主要集中在對基因集合的靶向分析方面，或是通過特異性捕獲檢測，或是從全外顯子測序中提取數據。原則上說，全基因組分析可能并且很快會被應用以提取相類似的數據，但全外顯子測序也能夠檢測到疾病的其他分子特征，因此其應用會更加廣泛。

　　有三個研討會討論了關于診斷性NGS的各個方面的問題。第一個是2013年2月25-26號在Leuven舉行，其初步的觀點于2013年3月7-8號在Prague舉辦的歐洲基因檢測科學大會上發布。第二次研討會是一個編輯研討會，于2013年10月1-2號在Leuven舉行，來自各個層面的人匯集在一起討論并起草有關文件，第一版文件于2013年11月21-22號在Nijmegen舉辦的第三屆研討會之前完成。最后一次研討會邀請了更多的利益相關者來對這個文件進行評價并形成聲明。最終的文件被提交到歐洲人類遺傳學會理事會，并于2015年7月1日獲得認可。

　　本文所呈現的是在撰寫指南過程中出現的聲明，這個聲明對指南進行了更加廣泛的闡述，可以作為指南的補充材料。這個補充材料同時也包括了定義、一般介紹，更加重要的是，還包括了一些實際的病例和模板。

　　技術發展水平

　　從某種意義上說可靠的NGS技術平臺尚不穩定，因為NGS的技術和應用變化太頻繁太快速。但是，這并不妨礙將這項技術應用于診斷，因為NGS給病人提供了潛在的全方位的好處。暫時還不能將這項技術應用于診斷的原因在于其質量較差，還不能給病人提供足夠的驗證試驗，目前也不能接受其應用于臨床診斷。

　　聲明01:根據目前的指南，NGS尚不能應用于臨床實踐，因為還沒有一項可接受的驗證試驗方法。

　　必須事先明確診斷試驗的目的是為了除外某種診斷還是為了確認某種診斷，因為這兩者之間有顯著的區別。這一區別主要取決于測試的完整性，這不但要求有不同的設置，更重要的是對診斷的不同看法。

　　聲明02:實驗室必須明確他們所提供的檢測是用于除外某種診斷，還是用于確認某種診斷。

　　診斷/臨床應用

　　將NGS應用于診斷的優勢是可以在相對較短的時間內以相對較低的費用對很多個基因進行一次性檢測，從而產生更多的分子診斷。

　　NGS的局限性取決于其所采用的平臺和富集方法，要想獲得高質量的診斷，在檢測之前必須考慮到這兩方面的問題，因為這會影響到對富集方法和測序平臺的選擇，以及必需進行哪些額外的測試。

　　聲明03:必須在驗證試驗開始之前就討論好要采用哪些試驗或分析方法，以及采用這些試驗或分析方法的目的，并且要將討論摘要寫入驗證報告中。

　　“診斷產出”被定義為檢出某種致病性變異并從而得出分子診斷的幾率。這個數值是通過每個病人隊列來計算的。這主要是從臨床層面來評價NGS的表現，也是評價該檢測的效率及其臨床應用價值的好指標。

　　聲明04:當一個實驗室考慮要將NGS應用于診斷時，他首先必須考慮其診斷產出。

　　在實踐工作中，診斷實驗室往往傾向于提供基因集合。當考慮實施診斷性試驗時必須要定義將某一個基因納入到集合中所需具備的條件。在理想的情況下，這個問題應該在一個專業學會的層面上、通過多學科討論的方式來解決，其目的是要給所有診斷試驗編撰一個基因名單，更重要的是要協調各種遺傳學檢測方法。當然，從病人和醫學從業者的角度來看，在整個歐洲能夠通用并且獲得同等價值則尤為重要。

　　聲明05:對診斷目的而言，只有那些異常基因型和表現型之間的關系（無論是通過已發表的論著還是通過驗證）已經明確的基因才能被納入分析。

　　對于那些與缺陷的主要部分相關的基因被稱為“核心基因”，其敏感性不會因為從Sanger測序轉化為NGS而受到影響。一個強有力的例子就是BRCA1和BRCA2基因，通過Sanger測序再加上缺失/重復分析，其敏感性可以達到99%。這一點也同樣適用于其他診斷產出很高的基因。增加其他基因無疑可以增加診斷產出，但這不能以漏檢用傳統方法就能夠被檢出的突變為代價。因此，能夠增加多少檢出率就成為確定核心基因名單的關鍵性決定因素。

　　聲明06:為避免不可靠的檢測，并兼顧病人的利益，“核心基因名單”應由臨床和實驗室專家共同制定。

　　實驗室會不考慮指南的規定而采用不同的NGS檢測設置（技術性的和診斷性的），事實上，也確實存在很多不適配于指南的各種情況。因此，我們提出了一個NGS診斷的評分標準，對不同的實驗室進行公平打分和簡易比較。

　　1.A類檢測：實驗室可以保證>99%的可靠參照要求或對不同編碼區域和側翼內含子區域的測序要求，用Sanger測序方法（或其他補充測序分析方法）來填充所有的缺口，并可以利用所采用的平臺來進行額外的分析，如均聚物延伸分析。

　　2.B類檢測：實驗室明確描述哪些區域達到>99%的可靠參照要求或其他測序要求，用Sanger測序方法填充部分缺口。

　　3.C類檢測：完全依賴于NGS本身的質量，不提供任何額外的Sanger測序或其他測序分析方法。

　　聲明07:采用基于覆蓋率和診斷產出的簡單評分標準可以對不同的實驗室所提供的診斷檢測進行對比。

　　知情同意以及提供給病人和臨床醫生的信息

　　基于NGS的診斷性試驗的應用取決于試驗步驟、所采用的平臺、濾過程序、以及實驗室所采用的數據儲存方法。因此，應充分告知咨詢醫生這一遺傳學檢測的局限性以及可能由此帶來的不良后果。

　　聲明08：實驗室必須對每一次NGS試驗都提供以下信息：靶向疾病、所檢測基因的名稱、已報道的檢測范圍、分析的敏感性和特異性，如果可能的話，還包括由于所檢測基因的突變所導至的和臨床表型不相關的疾病。

　　基于NGS的檢測的結果主要基于主動發現和次要發現的幾率，盡管主動發現是來自于和所檢測疾病相關的基因中，而次要發現是來自于和所檢測疾病的病因不相關的疾病基因中。

　　聲明09：診斷實驗室的分析渠道應集中在被研究的基因集合中，以避免產生次要發現，并且進行相應的驗證。

　　在一個基因集合中產生主動發現的幾率很低，這主要取決于所涉及的基因。但是，有可能會檢測到隱性情況下的雜合突變，因此而檢測到攜帶者。這將會對遺傳咨詢、生育選擇等產生影響。

　　聲明10：實驗室應提供產生主動發現的幾率方面的信息。

　　在實施一個基于NGS的試驗之前，臨床（遺傳學）中心需要建立一個“主動發現和次要發現規范”，該規范必須和倫理委員會的決議相一致。它必須在實驗室、研究所或國家層面上被決定，無論病人是選擇性接受還是拒絕接受獲得額外的、在最初診斷結果以外的信息。這個規范也應該詳細說明是否應報告主動發現和攜帶者狀態。實驗室應明確他們可以管理好各種不同的意見。

　　聲明11：如果一個臨床中心或實驗室決定給病人提供關于選擇性接受或拒絕接受有關不相關疾病的攜帶者狀態和次要發現的結果的選擇權時，他們需要涵蓋所有有關的可能性。

　　同時，必需要進行檢測前遺傳咨詢，內容應該包括對預期結果以及可能出現的主動發現和次要發現進行討論。咨詢必需提供足夠多的信息。

　　聲明12：應向病人清楚說明關于對主動發現和次要發現的解釋的實驗室政策。

　　聲明13：推薦通過書面的單張或在線方式向病人提供足夠的信息。

　　驗證

　　樣本的質量牽涉到很多方面的參數，例如產生數據的數量、PCR擴增的比例和覆蓋的比例。要達到診斷的目的，則只針對高質量的樣本進行分析，因此就必需確定高質量的靶基因集合、外顯子或基因組。

　　聲明14：所有用于診斷的關于NGS質量的參數必須被精確描述。

　　NGS技術要求對運行特異性和分析/樣本特異性特征進行監測。監測數據不必報告但應用于持續的驗證中。

　　聲明15：診斷性實驗室必須針對以下三個方面建立相關質量檢測的結構性數據庫：（1）檢測平臺；（2）所有分析；（3）所有樣本。

　　用于NGS工作流程的樣本追蹤方法非常復雜，包含了涉及到實驗室部分和計算機分析中的多個步驟。

　　聲明16：在對分析的評估當中應包括樣本追蹤和鑒別樣本的條碼設定的各個方面，這也包括在平臺驗證的內容中。

　　在平臺驗證中，實驗室必須確認其所有的設備和試劑都必須滿足制造商的要求。必須發現各個實驗室自身的局限性并且在檢測和數據分析的過程中充分考慮到這些因素。實驗室應區分這些問題是來自檢測平臺環節、測試特異性環節、或數據分析環節。

　　聲明17：一般平臺驗證部分應包括準確性和精確性驗證，這一工作不必在每次測試中重復進行。

　　顯然，每個測序技術都有其優勢和劣勢，生物信息工具必須反映出這些特征。

　　聲明18：生物信息流程必須和所采用的技術平臺相符。

　　診斷特異性的驗證流程必須采用分析的靈敏度和特異度來進行評估。例如，適用于SNP檢測的計算方法對于小的插入或缺失就不夠準確。實驗室必須明確這些特征，并且應充分測試各種不同的檢測流程。

　　聲明19：必須針對分析靈敏度和分析特異度分別建立不同的驗證流程。

　　任何有關化學、富集步驟、生物信息學分析平臺方面的改變都必須經過重新驗證。

　　聲明20：如果生物信息學流程（公共工具或商業軟件包）發生改變，診斷性實驗室必須用標準數據集對其進行驗證。

　　包含所有相關變量的內置數據庫提供了用于鑒別平臺特異性產物的工具，對驗證結果進行追蹤，并提供了對位點特異性數據庫和薈萃分析的互換。這一數據庫應允許進一步的注解（如，假陽性、已發表的突變、分離變量，等），從而使診斷過程更加合理。

　　聲明21：診斷實驗室必須針對現行的相關變量建立結構數據庫。

　　數據的儲存必須堅持用標準開放式文件格式FASTQ，BAM和VCF，這些也可用于和其他實驗室進行數據交換。當儲存分析結果的時候，必須同時儲存full-log文件。log文件應盡可能完善，使得從FASTQ數據到診斷報告的分析都可復制。可惜的是，尚無一個關于應儲存什么數據方面的國際共識，但是，對數據的儲存必須和國家的要求和常識。

　　聲明22：診斷性實驗室必須采取措施以保證對所有相關數據進行長期儲存

　　在進行任何分析之前必須定義臨床目標，即所有的編碼區域再加上保守剪切位點。臨床目標的確定則依據診斷試驗和限定的基因集合而定。

　　聲明23：在試驗過程中必須確定報告的范圍，即能夠獲得可靠結果的臨床目標，而且必須告知臨床醫生（通過報告形式或數字通訊方式）。

　　聲明24：對“可報告范圍”的要求依據分析目的而定。

　　例如，目的是獲得高診斷產出的外顯子測序就不需要進行那些以獲取在全基因組范圍內的高覆蓋率為目的所需要的額外分析，但卻需要和臨床醫生明確溝通說明，這一檢測不能用于除外某一種特定的臨床診斷。

　　必須通過準確性、分析靈敏度、分析特異度、精確性這些指標來評價診斷性試驗的表現。原則上講，這些都不是新要求但卻普遍被認為不易操作。但是，針對這方面的ISO標準是非常嚴格的。

　　聲明25：無論何時對試驗做出重大變更都應該檢查質量參數，必須重新檢測樣本。實驗室應事先確定好當改進或升級方法時要對哪種類型的樣本以及多少樣本量進行重新分析。

　　報告

　　NGS的結果應以清晰的方式發放，因為讀實驗室的報告的人既包括專家，也包括非專家。從實踐的立場來說，有臨床意義的結論、相關性試驗、以及試驗質量數據，應該在首頁上特別標示出來。

　　所有的病理性（5類）和可能病理性（4類）變異都應報告。是否報告未分類變異（UVs-3類）則根據各實驗室的實際情況而定，但實驗室科學家和開單醫生必須明確這些情況。

　　聲明27：實驗室自身的政策必須和國際指南保持一致，對于報告的基因變量，實驗室應在對其提供分析之前就明確界定，并記錄在案。

　　聲明28：必須收集UVs的數據，目的是最終對這些變異進行明確的分類。

　　需要有一個團體來收集和共享已知的數據，目的是最終將這些變異歸類為病理性（5類）或良性（1類）。

　　實驗室或研究所對主動發現和次要發現所采取的策略必須能夠反映在實驗室的日常工作和報告中。

　　聲明29：實驗室應該在開始試驗之前建立明確的步驟來闡述主動發現和次要發現。

　　鑒于這一領域中新的發現和進展，診斷性實驗室不應由于分析“舊”數據而超負荷。實驗室只提供在現階段已知的和已驗證的結果。

　　聲明30：不應期待實驗室去系統性重新分析舊的數據并報告新的發現，即使當核心疾病基因集合已經發生改變也不應如此。

　　從另一方面講，在一個特定的時刻，應由這一疾病的實驗室或團體的專家來將某一變異從某一級別更改至另一級別，實驗室則應負責重新分析可靠的數據，在新的證據基礎上重新發放報告，重新聯系開單臨床醫生，因為病人很可能會受到該變異的新的狀態的影響。在這種情況下，應該有一個體系來將病人和變異關聯起來，當變異被重新分類之后檢索受累病例。

　　聲明31：為了能夠管理好疾病變異，實驗室應建立自己的針對不同疾病的變異數據庫。

　　研究和診斷的區別

　　隨著在全基因組檢測用于診斷和研究的可能性逐漸增加，診斷和研究之間的分界就逐漸模糊起來，因此，闡述清楚對于診斷性資料，我們能做什么，應該做什么，需要簽署哪一種類型的分析特異性研究知情同意書，都是非常重要的事情。這并不排除對診斷性結果做進一步研究的建議，但是，在任何情況下都應該明確區分診斷和研究。

　　聲明32: 診斷性試驗是指任何一種直接回答和病人的醫療情況相關的臨床問題的試驗。

　　聲明33:研究性試驗是指提出一個假說，其結果可能會和該計劃中入組病人之間存在有限的臨床相關性。

　　聲明34:診斷性試驗的結果，尤其是全外顯子或全基因組分析的結果，可以是產生自某個假說。

　　在診斷過程中采用獲自NGS的外顯子或基因組數據是可以被接受的，如果其目的是為了獲得一個遺傳學診斷、且其分析僅限于那些已知和某種疾病相關的基因。

　　聲明35: 如果診斷性試驗的主要目的是給某一個病人做出診斷，那么該試驗應該在認證實驗室進行。

　　當病人及其家屬參加某一個研究計劃時，他們必須要明確這樣的計劃可能會獲得和某種遺傳性疾病相關的診斷或預測性的信息。在研究中，臨床相關性的結果只能在獲得診斷性試驗確認之后才能發送至病人的醫療記錄中。

　　聲明36:在將研究性結果發送給病人之前必須在認證實驗室確認該結果。

　　為了使對變異的解釋更加容易，大多數實驗室會給所有在自己實驗室進行測序/分析的樣本（理想的情況是有健康的父母）的變異頻率建立數據庫。這樣的數據庫不包括任何敏感信息，基于隱私規則的考慮也不權衡這些數據對提高診斷水平和改善健康保健的重要性。

　　聲明37:所有在診斷性或研究性試驗中獲得的健康個體的變異頻率都應被分享。

　　在理想的情況下，所有檢測到的和疾病相關基因的變異都應該發送到病理性變異的數據庫中，并且將其與病人的臨床資料相關聯，同時也要明確描述對變異分類的標準和爭議。

　　聲明38:所有報道的變異都應該發送至聯邦、地區、國家、和/或國際數據庫分享。

　　文獻引自：Matthijs G, Souche E, Alders M, et al.Guidelines for diagnostic next-generation sequencing. Euro J Hum Genet.2016;24:2-5