除臨床癥狀和體征外，21-羥化酶缺乏癥患者的確診主要依靠實驗室檢查。
1.普通生化
失鹽型患者多于新生兒早期出現明顯的高鉀低鈉血癥及低血糖癥，在感染、外傷、疲勞等應激狀態時加重。
2.特殊檢查
對于女性假兩性畸形和男性非促性腺激素釋放激素依賴性性早熟患者，應考慮21-羥化酶缺乏癥的可能性，實驗室檢查發現尿17-酮類固醇和17-生酮類固醇排量增高和（或）血清17-羥類固醇和雄烯二酮水平增高可以確診。
3.B超檢查
雙側腎上腺肥大。對于經典型21-羥化酶缺乏癥診斷并不困難，但對于非經典型21-羥化酶缺乏癥患者，應與特發性性早熟、腎上腺男性化腫瘤、性腺腫瘤、特發性多毛癥等疾病鑒別。
4.基因檢測
CYP21A2基因檢測可作為診斷方法之一。