沒有實驗室檢查能確診5-羥色胺綜合征。當病人存在震顫、陣攣或者靜坐不能而不伴有其他錐體外束體征時，應使臨床醫師考慮到該診斷，必須根據病人的病史和體格檢查做出推斷。在獲取病史時，醫師應該了解病人使用處方藥和非處方藥、違禁藥和膳食補充劑的情況，因為所有這些藥物都與5-羥色胺綜合征的發生相關。還要對癥狀的演變及其變化速度進行詳細評價。體格檢查應該重點評估腱反射、陣攣和肌肉強直，此外還要評估瞳孔的大小和反應性、口腔黏膜干燥情況、腸鳴音強度、皮膚顏色以及有無出汗。
盡管已經提出了幾個診斷標準，但我們描述的診斷規則。在診斷5-羥色胺綜合征時，這些規則比原有標準更簡單、更敏感（84%對75%）和更特異（97%對96%）。（誘發的、自發的和眼球的）陣攣是建立5-羥色胺綜合征診斷的最重要表現。臨床醫師應該始終意識到，高熱和肌張力亢進發生于有生命危險的病例，但肌肉強直可能會掩蓋陣攣和反射亢進這種很有鑒別意義的表現，并因此模糊了5-羥色胺綜合征的診斷。
鑒別診斷包括抗膽堿能藥物中毒、惡性高熱和抗精神病藥物惡性綜合征，這幾種疾病每種都可以依靠臨床背景和用藥史而很容易地與5-羥色胺綜合征進行鑒別。抗膽堿能綜合征病人反射正常，并表現為“中毒癥候群”：瞳孔散大；躁動性譫妄；口腔黏膜干燥；皮膚發熱、干燥、有紅斑；尿潴留；腸鳴音消失。腸鳴音亢進加上神經肌肉異常、出汗和正常皮膚顏色可以區分5-羥色胺綜合征與抗膽堿能中毒癥候群。
惡性高熱是一種藥物遺傳學異常，其特征是潮氣末二氧化碳濃度升高、張力亢進、高熱和代謝性酸中度。該病發生于暴露吸入麻醉劑后數分鐘內。體檢時，皮膚往往呈現為發紺區與鮮紅色斑形成對比的花斑狀。惡性高熱中觀察到的僵尸樣骨骼肌強直和反射減弱可以進一步將該病與5羥色胺綜合征進行區別。
抗精神病藥物惡性綜合征是一種對多巴胺拮抗劑的特發性反應，該病被定義為：緩慢發病、運動徐緩或運動不能、“鉛管樣”肌肉強直、高熱、意識波動和自主神經失調。與5-羥色胺綜合征的迅速發作和運動機能亢進形成對比，抗精神病藥物惡性綜合征的體征和癥狀通常在數日內進展。了解誘發疾病的藥物也有助于區分兩種綜合征：多巴胺拮抗劑產生運動徐緩，而5-羥色胺激動劑產生運動機能亢進。