堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內,線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時,共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起,因此復性迅速而準確,而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開,復性就不會那么迅速而準確,它們纏繞形成網狀結構,通過離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA,蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。