誘變物質的微核測定實驗

實驗方法原理：微核（micronuclei)簡稱（MCN）是真核類生物細胞中的一種異常結構，往往是細胞經輻射或化學藥物的作用而產生的。在細胞間期，微核呈圓形，游離于主核之外，大小應在主核1/3以下。微核的折光率及細胞化學反應性質和主核一樣，也具有伍萬DNA的能力。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒斷片產生的。研究工作證實：整條染色體或好幾條也能形成微核。這些斷片或染色體在比細胞分裂未期被兩個子細胞核所排斥便形成了第三個核塊。已經證實微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應呈正相關，這一點和染色體畸變的情況是一樣的。所以許多人認為可用簡易的間期微核計數來代替繁雜的中期畸變染色體計數。由于大量新的化合物的合成，原子能的應用，各種各樣的工業廢物的排出，使人們需要有一套高度靈敏，技術簡單的測試系統來監視環境的變化。只有真核類的測試系統更能直接推測誘變物質對人類或其它高等生物的遺傳危害。在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。目前國內外不少部門已把“微核測試用于輻射損傷、輻射防護、化學誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。

現有的微核測試系統多數是用哺乳動物的骨髓細胞或外周血細胞，其缺點是需要一定的培養條件與時間，且細胞同步化困難，微核率低，一般只在0.2%左右。近年來，有人采用高等植物花粉孢子，利用天然的同步性作微核測試材料。取得良好的效果。其中馬德修用一種原產于美洲的鴨跖草（Tradescantia paludosa）,建立四分孢子期微核率計數（MCN-in-Tetrad）的測試系統，是近年來普遍認為較好系統之一。該系統用低劑量的化學藥物處理或輻射處理，其微核率可達10%-67%。

本實驗改用簡單易行的煙草種子進行發芽，用一定濃度的鹽酸平陽霉素進行處理，以計微核的誘變率。

實驗材料：煙草種子  

試劑、試劑盒：

鹽酸平陽霉素                                                                 

固定液 

儀器、耗材：

三角瓶                                                                  

剪刀                                                                  

鑷子                                                                  

載玻片                                                                 

蓋玻片 

實驗步驟：

一、實驗材料

將煙草種子用40℃溫水中浸泡40分鐘，用布包住種子輕輕撮，之后，置具有吸水紙的培養皿中于25-28℃下催芽，大約三天左右，待幼根長到2-4mm左右，將萌芽的種子置入一定濃度的鹽酸平陽霉素中進行誘變5-8小時，用清水沖洗三到五遍，再培養過夜后，用固定液固定待用。

二、實驗器具和藥品

1、鹽酸平陽霉素，配制20m g/ml、40 m g/ml、80 m g/ml濃度的溶液

2、固定液：3甲醇：1冰醋酸

3、染色液

4、實驗用具：三角瓶，剪刀，鑷子，載玻片，蓋玻片等

三、實驗說明

處在分裂時期的細胞，對理化因素的處理是有一定敏感時期的。煙草糼根在17：00-24：00對平陽霉素的處理較為敏感。處理過程中所產生的落后染色體或落后染色體組也能在中期染色體中表現。

四、實驗步驟

1、將煙草種子用40℃溫水中浸泡40分鐘，用布包住種子輕輕撮，之后，置具有吸水紙的培養皿中于25-28℃下催芽（或置入盛有蒸餾水的三角瓶中25-28℃振蕩培養），大約2-3天左右，待幼根長到2-4mm左右。

2、將萌芽的種子分別置入20m g/ml、40 m g/ml、80 m g/ml濃度的鹽酸平陽霉素中進行誘變5-8小時，用清水沖洗三到五遍，再培養過夜后，用固定液固定待用。

3、、挑取適當經誘變后的幼根，換以70%，50%，30%酒精中各10分鐘，蒸餾水沖洗兩次。

4、60℃1NHCL中3-5分鐘，再放入1N冷HCL中1分鐘，取出用清水稍微沖洗后，置載玻片上，滴少量染色液，蓋上蓋玻片，輕輕敲打，使根尖細胞分散，置顯微鏡下觀察。

5、對照以下圖片說明，比較所觀察到的結果。

圖片說明：1，微核，; 2 小核，；3，雙核，；4，核出芽；5，核縊縮；6，核耳；

7，橋+落后染色體；8，橋+染色體斷片；9雙橋；10，多橋；11游離染色體，

12染色體粘連；   注：以上圖片為   X 200