各位老師在做熒光定量PCR實驗的時候，是否遇到過非標準“S”型曲線的問題呢？俗話說的好，完美的PCR擴增曲線“千篇一律”，而有問題的PCR擴增曲線則是“千姿百態”。今天給大家分享一個案例：客戶反映做絕對定量過程中，擴增曲線在線性增長期出現熒光信號突然下降的情況，在多組分圖（Multicomponent Plot）中查看原始信號采集情況時，這種現象更加明顯。
好好的擴增曲線怎么就突然“不走尋常路”了，到底是“誰”動了我的擴增曲線呢？
其實，這種現象并不是偶發的，有很多原因可能導至，并且有個專屬名稱“Hook Effect”，翻譯過來叫“魚鉤效應”。“魚鉤效應”指在熒光定量PCR過程中，DNA擴增到指數增長期后出現的一種熒光信號不能保持穩定（或者上升）而出現下降的現象[1]。
導致擴增曲線出現這一現象的因素比較復雜，這里我們分別從嵌入性染料法與探針法兩種定量方式的角度為大家解釋：
嵌入性染料法：
嵌入性染料法（例如SYBR Green I）產生“魚鉤效應”主要是由于模板序列混雜，在PCR過程中易形成異源雙鏈，造成同源/異源產物并存的狀態，而異源雙鏈熔解溫度要低于同源雙鏈。
在PCR反應最初的幾個循環，引物充足，延伸步驟產生的DNA雙鏈完美匹配，100%互補，熔解溫度比較高；隨著循環數增加，PCR產物不斷累積，引物退火與產物自退火之間形成競爭，異源雙鏈產生，阻礙了引物的退火和延伸；若異源雙鏈熔解溫度低于延伸反應溫度（即熒光信號采集溫度），則會在熒光采集步驟發生解鏈反應，導至熒光信號下降[1]。隨著自退火產物的增加，“魚鉤效應”更加明顯。
這種“魚鉤效應”我們平時遇到的并不多，究竟什么樣的模板能夠在擴增過程中產生異源雙鏈呢？主要是那些產物序列中既有一致性序列又有差異性序列的應用，例如：帶有統一接頭序列的NGS文庫定量、帶有一致保守區序列的16S 宏基因組定量，以及定量模板中含有突變位點的應用都可能產生異源雙鏈。
圖2. PCR擴增異質靶標，產物自退火引發“魚鉤效應” [1] 圖3. 嵌入性染料法熒光定量消除“魚鉤效應”的方式 [1] 雖然能夠引起“魚鉤效應”的異源雙鏈錯配程度無法估計，但單堿基水平錯配還不足以引起PCR產物熔解溫度發生明顯改變。
探針法：
除了染料法，探針法熒光定量PCR實驗也有可能產生“魚鉤效應”。采用雜交探針，擴增子鏈和探針之間會形成競爭，熒光信號明顯下降，一般發生在模板濃度比較高、單鏈擴增子重新退火的速度比其與探針結合速度更快的情況下。Barratt等人采用一步法對HSV病毒進行分型，結果發現擴增曲線產生了“魚鉤效應”，為了使反應能更多地產生與探針結合的那條單鏈，他們采用了不對稱PCR（反向引物濃度高于正向引物濃度）的方式，大大改善了“魚鉤效應” [2]。 最后，我們回到文章開頭的那個案例，溝通后我們發現客戶采用的是SYBR Green I
染料法對NGS文庫進行絕對定量，NGS文庫構建過程中，需要在測序片段兩端加上可以被測序儀識別的“接頭”序列，而這些“接頭”大部分序列是一致的，導至文庫中存在大量異質但又相互關聯的DNA序列，在定量過程中形成異質雙鏈，進而引發了“魚鉤效應”。
“魚鉤效應”對靈敏度、熔解曲線、數據分析有一定的影響，但這種現象一般發生在指數增長期之后，對數據分析著眼點放在指數增長期的絕對定量和相對定量結果影響不大 [3]；但如果您是做等位基因分型或者法醫相關應用，可以根據實際情況，通過合理設置基線、適當調整模板及PCR反應體系其他組分的濃度、降低反應循環數以及進行不對稱PCR的方式來改善結果。