質粒DNA大量制備實驗——平衡離心法

這種方法可以得到除去了大多數雜質的高純度質粒DNA。但它需要使用溴化乙錠，并且需要長時間的超速離心來形成密度梯度。

DNA

TE氯化銫溴化乙錠NaCl乙醇

離心機平衡住

1.  粗裂解物制備方案最后一步得到的沉淀溶于4 ml TE緩沖液中，加入4.4 g CsCl，溶解后，再加入0.4 ml 10 mg/ml 溴化乙錠。

2.   將溶液轉入一個5 ml 的quick-seal快速封口的超離心管中。

3.  酌情往管中加入CsCl/TE溶液，封好離心管。

4.  于20℃，500 000 g離心 3.5 h或于20 ℃，以350 000 g 離心14 h 以上。

5.  首先從管的頂端描入一支針頭，然后用帶另一 20G針頭的3 ml 注射器將質粒帶吸出。

6.  進行第二次超速離心，除去混雜的RNA和染色體DNA以獲得更高純度的質粒。

7.  按質粒溶液的1.5~2倍體積裝Dowex AG50W-X8柱子，用數倍體積的TE/0.2 ml NaCl溶液清洙和平衡柱子。

8.  用注射器將混合有溴化乙錠的質粒DNA溶液直接加到樹脂的頂部，注意不要搖動樹脂。

9.  立即收集流出液，然后用2倍于上樣體積的TE/0.2 ml NaCl溶液洗脫柱子兩次。

10.  加入2倍體積乙醇于室溫或-20℃沉淀質粒DNA，于4℃，以10 000 g 離心 10 min。

11.  沉淀用70%乙醉洗滌1遍，真空干燥，溶解于TE緩沖液，并于4 ℃保存。

一、溴化乙錠是一種誘變劑并能造成環境污染，操作時應戴手套，并且妥善處理。

二、為了防止紫外線對眼睛的嚴重拫傷，應戴紫外防護眼鏡或面罩。