實驗方法原理 這一方案科能是最常用的質粒制備方法,該法不僅相當決捷可靠,而且可獲得相當純凈的粗制DNA。
實驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 葡萄糖TrisEDTATENaOHSDS異丙醇乙醇乙酸甲
儀器、耗材 離心機漩渦混合器水浴鍋
實驗步驟
1. 往2 ml 燒瓶中加入500 ml ,含有適當抗生素的LB培養基,然后加入5 ml 過夜培養的。
2. 帶有所需質粒的大腸桿菌培養物,再于37℃培養至飽和狀態(OD600≈4)。
3. 于4℃,6 000 g 離心10 min,用4 ml GTE。
4. 溶液重懸沉淀,并轉移到一個容積≥20 ml 的高速離心管中。(細菌沉淀可以在-20℃或-70℃無限期保存。)
5. 加入1 ml 新配的含25 mg/ml 溶菌酶的GTE溶液,重懸沉淀,于室溫放置10 min。
6. 加入10 ml 新配的NaOH/SDS溶液,并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠。于冰上放置10 min。
7. 加入7.5 ml 乙酸鉀溶液,用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀,于冰上放置 10 min。
8. 于4℃,20 000 g 離心10 min 將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中,如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾。
9. 加入0.6倍體積的異丙醇,顛倒混勻,室溫放置5~10 min。
10. 于室溫1500 g 離心10 min。
11. 加入2 ml 70%乙酵輕輕洗滌沉淀,然后短暫快速離心,吸去乙醇,并真空干燥。
12. 沉淀可以在4℃無限期保存。