質粒DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測

1、堿變性法提取質粒DNA：細菌培養物加入SDS和NaOH堿性溶液處理后，菌體裂解，可使細菌的質粒DNA、染色體DNA和RNA一起從細胞內釋放出來，經瓊脂糖凝膠電泳，因各種核酸分子的遷移率不同將上述核酸分成不同的帶。用溴化乙錠（EB）染色后，在紫外線燈下可看到各種核酸帶發出的熒光。根據熒光的位置，可區分不同的核酸帶。

2、瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳技術（Agarosegelelectroghoresis）是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。凝膠分辨率決定于使用材料的濃度，并由此決定凝膠的孔徑。瓊脂糖凝膠可分辯0.1——6.0kb的雙鏈DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳是一個電場作用。它首先利用瓊脂糖的分子篩效應，此外，在弱堿性條件下，DNA分子帶負電荷，從負極向正極移動。根據DNA分子大小、結構及所帶電荷的不同，它們以不同的速率通過介質運動而相互分離。借助溴化乙錠（EB）能與雙鏈DNA結合的作用，利用EB染色，并通過紫外線激發即可觀察被分離DNA片段的位置。

E.coliJM109E.coliRRI

TE緩沖液KAc溶液葡萄糖Tris.HclLB液體培養基

離心機EP管恒溫培養箱凝膠槽電泳儀

一、堿變性法提取質粒DNA

1.接種細菌于5mlLB液體培養基中，37℃培養過夜。

2.3000rpm/min，離心15min，棄上清。加入100ul溶液Ⅰ懸起細菌沉淀。

3.加入200ul前新配制的溶液II，顛倒EP管5次混合均勻，置冰浴2min。

4.加入150ul溶液III溫和地混勻，12000rpm/min,離心5min。

5.吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇抽提2次，12000rpm/min，離心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍體積的冷乙醇，12000rpm/min，離心10min。

6.棄乙醇，干燥后用30ulTE緩沖液洗下核酸，待電泳檢測。

二、瓊脂糖凝膠電泳

1.取瓊脂糖0.9g，加入100ml1xTAE電泳緩沖液于250ml燒瓶中，100℃加熱溶解。

2.平衡凝膠槽，放好兩側擋板，調節好梳子與底板的距離（一般高出底板0.5——1mm）。

3.鋪板：在溶解好的凝膠中加入終濃度為0.5ug/ml的溴化乙錠水溶液，輕輕混勻，待冷至50℃左右倒入凝膠槽，膠厚一般為5——8mm。

4.待膠徹底凝固后，去掉兩側擋板，將凝膠放入盛有電泳液的槽中（加樣孔朝向負極端，DNA由負極向正極移動），使液面高出凝膠2——3mm，小心拔出梳子。

5.DNA樣品與載體緩沖液5：1混合并加入凹孔中（樣品不可溢出）。

6.打開電源，調節所需電壓，電壓與凝膠的長度有關，一般使用電壓不超過5v/cm。

7.據指示染料移動的位置，確定電泳是否終止（溴酚藍的涌動距離在5sRNA和0.3kbDNA帶之間）。

8.電泳完畢關閉電源。將凝膠放紫外燈下觀察并拍照。

1. 在紫外燈下觀察室應該帶上防護眼鏡，以免強紫外光傷害眼睛。

2. 如果DNA條帶不夠窄且不夠均勻，可能是以下幾個方面造成的：①DNA過載，②電壓過高，③加樣孔破損，④凝膠中有氣泡。

1. 凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質量的DNA，也可以分離相對分子質量的相同但是構型不同的DNA分子，藥物不同構型的分子在凝膠電泳上面的遷移率也是不同的。

2. DNA的分子越小，遷移速度越快；瓊脂糖的濃度越低，遷移速度越快，DNA環狀的或帶切口環狀的通常都比線裝的DNA遷移速度快。