質粒DNA提取實驗

堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性，再將pH值調至中性使其復性，復性的為質粒DNA，而染色體DNA不會復性，纏結成網狀物質，通過離心除去。

大腸桿菌

Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 異丙醇 溶菌酶 酚:氯仿 無水乙醇 LB培養基

超凈工作臺 培養箱 搖床 恒溫水浴鍋 臺式離心機 取液器 低溫冰箱 冷凍真空干燥機 電泳儀 水平電泳槽 紫外觀測儀

一、材料與試劑準備

1.  材料：大腸桿菌。

2.  儀器：超凈工作臺，培養箱，搖床，恒溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空干燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀。

3.  試劑：

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高壓滅菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 現配現用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高壓滅菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc pH5.2，高壓滅菌，4℃保存。

（5）異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70%乙醇，LB培養基，電泳試劑。

二、操作步驟

1.  細菌繁殖：LB培養基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，搖一搖，過夜。

2.  離心10 min，5 000 rpm， 4℃；棄上淸液。

3.  沉淀（菌體細胞）預冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入預冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4.  重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。

5.  加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

6.  加入0.9 ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4℃。

7.  加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內放置15 min。

8.  離心10 min，12 000 rpm，4℃。

9.  取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。

10.  加入40 ul，3 M NaAc。

11.  酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。

12.  離心10 min，12 000 rpm，4℃。

13.  取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。

14.  電泳檢測提取DNA的質量。