質粒DNA的限制性內切酶酶切分析

實驗目的

學習和掌握限制性內切酶的特性

掌握對重組質粒進行限制性內切酶酶切的原理和方法

并理解限制性內切酶是DNA重組技術的關鍵工具。

相關基礎知識

限制性核酸內切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。它是基因工程中用于體外剪切基因片段的重要工具酶。

上世紀七十年代，當人們在對噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現象進行研究時，首次發現了限制性內切酶。首批被發現的限制性內切酶包括來源于大腸桿菌的EcoR I和EcoR II，以及來源于流感嗜血桿菌(Heamophilus influenzae)的Hind II和Hind III。這些酶可在特定位點切開DNA，產生可體外連接的基因片段。研究者很快發現內切酶是研究基因組成、功能及表達非常有用的工具。

1)寄主控制的限制與修飾現象

限制與修飾系統是細菌細胞的一種防衛手段。各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現象被稱為寄主控制的限制與修飾現象。

2)限制性核酸內切酶的類型及特性

按限制酶的亞基組成和切斷核酸情況 的不同，分為三類：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型

第一類（I型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，其切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如Eco B、Eco K等。

第三類（III型）限制性內切酶也有專一的識別順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對也不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此也不能應用于基因克隆。

第二類(II型)限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。

這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。這種酶的切割可以有兩種方式：

粘性末端 ；是交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。