質譜+MassWorks給您更好的有機物定性結果

　　2011年11月10日，MassWorks發明人王永東博士做客分析測試百科網，向廣大網友做了題為《質譜+MassWorks給您更好的有機物定性結果》的報告，共同探討MassWorks如何讓您的質譜獲得更好、更準的化合物鑒定結果。MassWorks在2006年投放市場，即獲年度匹茲堡Pittcon最富創新產品的銅制獎章。它改變了人們使用質譜的傳統觀念，拓展了世界上多種類型質譜的潛能。MassWorks在四極桿質譜上可提高100倍以上的質量準確度；并在獲得準確質量的各種質譜（四極桿/飛行時間/FT ICR/Orbitrap）上，利用先進的譜圖準確度匹配技術，獲得化合物鑒定近乎完美的結果。

　　譜圖校正理論

　　關于有機化合物確認，美國《有機化學雜志》要求最為嚴格，在2011年1月份之前規定：若要在該雜志發表文章，必須使用高分辨質譜確認，而且質量精度要達到5ppm，許多質譜工作者都認為此條文不合理。在1月份之后，該條文做了修改，不再要求是高分辨質譜，而且質量精度變為3mDa。3mDa質量精度在小分子(<100Da)具有很強的殺傷力，但是在大分子(e.g.，400Da)并不充分。對于分子量是91，若能把質量測到3mDa，就只有一個分子式；如果分子量是400，就有317個可能性，此時分子確認的可靠性就差了很多。

有機化合物分子式確認

　　對于上面的問題，許多廠商都提出使用高分辨質譜，雖然質量誤差可以達到100ppb，但依然有7個分子式，而且質量到小數點第四位都還是相同的，即便可以根據電荷數去掉兩個，依然很難確定剩下的5個分子式中哪個是對的。王博士模擬了這5個分子式的理論質譜圖，對400的那個峰進行放大，可以發現它們依次是由¹⁵N、³³S、¹³C和²H形成的，這是在高分辨質譜上。在低分辨質譜上，由于質量精度不夠，信息被加和在一起了，但信息是客觀存在的，只要譜圖是準確的，即可以對其進行校正。通過理論質譜圖和實際質譜圖進行比較，利用校正曲線去校正實際質譜圖，得到的譜圖就比較完美了。從而可以輕松確定質心、位置、高度、寬度和面積，即獲得了精確質量，誤差在±0.002~0.005Da，質量精度提高了100倍。為了獲得唯一的分子式，就需要使用譜圖準確度，對可能的分子式模擬出理論質譜圖，與校正后的質譜圖進行比較，如果匹配的完美無缺，即可認為這個就是可能的分子式。

低分辨質譜上具有豐富的峰形信息

獨特的質譜校正方法

　　MassWorks與AutoID及其應用

　　根據譜圖準確度理論，王博士推出了兩款產品：一是MassWorks研究軟件，可以應用在四極桿GC/MS和LC/MS的分子識別，及TOF、Orbitrap、FT ICR MS等高分辨質譜；另一是AutoID 全自動解決方案，用于實時、在線分析LC/MS，可以高通量、批處理樣品。

　　MassWorks可運用于所有的GC/MS系統，易選擇、易操作，離子碎片分布在45-550Da范圍內，而且可用于內標法。對未知物分析時，通過峰形校正去除了一起自生的線性峰形，同時將質量精確度提高了100倍以上。對可能的80-100個分子式，怎樣判斷哪一個是正確的分子式?一個方法是根據質量誤差進行排序，卻得出了一個錯位的結果，而根據譜圖準確度實現了分子式的準確識別，并得出了正確結果。對于高分辨質譜，MassWorks也能幫上忙，對單同位素峰提供完美的峰形校正。

GC/MS分子式識別

　　大分子藥對人體副作用比較小，因此越來越受到人們的關注，可卻存在一個降解的問題。如胞核嘧啶水解脫胺產生尿嘧啶，5-甲基胞核嘧啶水解脫胺產生胸肝。在37℃ Cand pH 7.4條件下，ssDNA中胞核嘧啶和5-甲基胞核嘧啶片段的脫氨基速率分別為2×10^-10s^-1和1×10^-9s^-1；或者在pH 7.4和37℃條件一年后，一條含4個5-甲基胞核嘧啶的序列片段中含有11%只有一個位點被脫氨基的分子，pH值越高脫胺速度越快。低聚核苷酸有10%甚至2%降解，如何檢測其中少量的脫氨基成分?用一般的分析方法，譜圖基本一樣，而用MassWorks軟件可以分析它的降解率，甚至是低于2%的降解率也可以檢測。

MassWorks軟件可用于檢測低于2%的脫氨基成分

　　AutoID是全自動軟件，非常適合大批量合成有機物的驗證，AutoID開放式校正流程如下圖。對于給定的目標化合物，質量誤差6mDa，譜圖準確度高達99%，質譜峰形覆蓋良好；對未發現的目標化合物也可以檢測，AutoID自動識別排在前三位的未知分子式，比較分子式的理論質譜圖與校正質譜圖，從而確定可能正確的分子式。

AutoID開放式校正流程

　　最后，王博士總結說，對于有機物確認，質量精度很重要，譜圖準確度更加重要，線性峰形校正是區分相似候選分子式的關鍵。開放的全自動分子式識別技術可實時應用于單四極桿質譜，而且可應用于高分辨MS，通過譜圖準確度實現錯誤分子式的排除和定量分析。

　　Q&A

　　網友：有沒有使用MassWorks軟件分析氮同位素的例子?

　　王永東博士：還沒有。目前分析過¹²C、¹³C和¹⁴C，其中¹⁴C非天然，是放射性元素;氫分析過氘和氕。分析氮同位素，原理是一樣的，應該可以。

　　網友：質量校正的方法是否能夠解決單四極桿假陽性的問題?

　　王永東博士：譜圖準確度可以去除掉很多假陽性。正如報告中所講到的，用質量精確度得出很多種可能的分子式，最后選出甚至是錯誤的結果，而用譜圖準確度能夠更好地選擇，減少假陽性。

　　網友：請介紹一下Bruker的MW to formular軟件與massworks性能比較的情況?

　　王永東博士：MW to formular軟件也在試圖介紹同位素理論值與實驗值的差別，作為篩選同位素的途徑。兩者之間最大的區別是，molweight to formular軟件不對峰形進行校正，它假設實驗數據符合某種分布，這種假設本身就存在百分之幾的誤差，這對于分析相近的分子式來說是很大的誤差，所以其對分析幫不上太多的忙。

　　網友：MassWorks軟件在殘留分析中(1ppb)的作用?

　　王永東博士：分析農殘有的是未知的，有的是在分析列表中有的進行定性和定量，可以利用MassWorks的質量精確度和譜圖準確度來做離子提取圖。輸入一個表列，包含可能含有的殘留的分子式，然后就去搜尋某種殘留是否存在，根據質量精確度和同位素分布進行計算，所以對農殘分析也是很有用的。

　　網友：MassWorks軟件可以在ICP-MS上使用嗎?

　　王永東博士：現在還不行。MassWorks軟件是設計給有機質譜用的，很快就會有應用于無機質譜的，是對MassWorks軟件性能的增加。

　　網友：在背景很雜很高的情況下，MassWorks的優越性還能很好發揮嗎?

　　王永東博士：如果背景很高，就是有干擾，而且干擾不能很好地分離，甚至出峰時間和質量都接近，在這種情況下，對MassWorks就會有影響了，就會提示譜圖準確度差了很多，此時可以用高分辨質譜進行分析。

　　網友：NIST譜庫中匹配率低，能否用MassWorks軟件?

　　王永東博士：這是MassWorks軟件的優勢之一。若在nist譜庫中匹配率很低的話，就用MassWorks去看分子離子峰或者是碎片峰，篩選出正確的分子式。造成nist譜庫匹配率低的原因可能有，多種化合物在同一時間出峰，還有就是信噪比低。

　　網友：食品中非法添加物能否用質譜分析一次性全部測定?

　　王永東博士：這是可能的。它跟AutoID比較相近，有機合成工作者知道是什么東西，不外乎是產物與反應物，通過一次測定可以把它們全部確定下來。食品中非法添加物假如有200種，它們的分子式是知道的，通過LCMS篩選，再用質量精確度和譜圖準確度來確定。

　　網友：做藥物代謝的時候，對于未知代謝物的推斷，譜庫里沒有的物質是不是推斷不出來?

　　王永東博士：現在大部分是不需要庫的，庫里存在的可以把它找到，不存在的也可根據譜圖把它推斷出來，推出來之后就把它保存在庫里，備以后篩選用。特別是對于代謝組學里的應用，分析未知的代謝物是很常見的。

　　網友：用AutoID的那些合成實驗室，一般用的是什么質譜?是單四極桿嗎?

　　王永東博士：一般用的是單四極桿LCMS、GCMS，因為它比較穩定，而且操作簡單，不容易出問題，即便出了問題也比較容易修。

　　網友：請介紹一下Mass Works軟件在推斷未知代謝物中的應用?

　　王永東博士：首先確定與藥物是有關的，需用¹⁴C去標記，然后跟蹤它的變化。對有¹⁴C的代謝物進行分子式和結構進行確定，即可推斷未知代謝物。這在制藥和香精、香料方面有這樣的用戶。

　　網友：MassWorks 推算出來的物質是否有可能是不存在的，而只是為了實現分子量的匹配做的推算?

　　王永東博士：這是有可能的。因為我們不用庫，所以推算出來的分子式有可能是不存在的，當然對分子式的推算有諸多的限制，盡可能找到可能的、合理的分子式。另外，有些分子是以前沒有合成的，經過推算還可以把它合成出來。如果限制太多，就有可能錯過一些新的、以前沒有的化合物。MassWorks軟件的限制是可以設置的，取決于研究的目的。

　　網友：你在報告中提到的校正譜圖和標準譜圖比對來求譜圖準確度，那么標準譜圖是理論推導的，還是實際用標樣測得的呢?

　　王永東博士：校正譜圖是實際測樣得到的譜圖進行校正，標準譜圖是根據分子式結構進行推算的，然后再求譜圖準確度。

　　網友：正確應用MassWorks軟件，對采集MS譜圖有怎樣的質量要求?

　　王永東博士：獲得的數據要能夠作圖，而且采點要8個以上，測量時要有一個標樣，校正時信噪比越高越好。

　　網友：對于理論質譜圖，是將條件默認為70eV嗎?

　　王永東博士：計算理論質譜圖，只需要分子式和峰形函數。分子式是已知的，峰形函數就用校正以后譜圖的峰形函數。理論質譜圖對應一個分子式和一個峰形函數，不需要任何假設。所提到的70eV是與離子源的電壓有關系的，50eV和70eV在實驗中是不一樣的，可以用MassWorks軟件校正，轉化到同一個能量下進行比較。

　　網友：進行環境樣品中未知物的分析時，目標物的濃度都很低，有時在質譜上打不出來，MassWorks軟件能否發揮作用?

　　王永東博士：要對未知物進行富集，或者質量掃描范圍縮短，從而提高信噪比。

　　網友：能否介紹一下MassWorks在NCI和PCI源方面的應用情況?

　　王永東博士：即便同一臺質譜儀，若離子源不同，則質量精確度和離子阱也會不同。所以，需要在相同離子源的同一臺質譜條件上，使用MassWorks軟件來鑒定未知物。另外，在正、負條件下進行校正時，都分別需要標樣。