質譜儀在臨床病原菌感染診斷中的應用

質譜（mass spectrometry）分析是一種測量離子荷質比（電荷-質量比）的分析方法，可用來分析同位素成分、有機物構造及元素成分等。質譜儀最早的臨床應用主要在于檢測一些生物標記物以幫助診斷癌癥和遺傳疾病等。20世紀80年代，基質輔助激光解析電離（matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）技術的發明使得質譜能夠檢測生物大分子，該發明在2002年榮獲諾貝爾獎。此后，以MALDI技術為基礎的飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）在臨床得到了更廣泛的應用，尤其是對微生物標本的快速鑒定。

一、質譜鑒定微生物的原理

在應用MALDI-TOF MS時，通常將微生物樣本與一種飽和的低分子量無機化合物溶液（稱為基質）進行混合加在靶板上，待干后樣本與基質共結晶后形成了以基質包裹構架的樣本固體沉淀。樣本基質結晶體經激光輻射，基質從激光中吸收能量使樣品吸附，基質與樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，離子在加速電場下獲得相同的動能，經高壓加速、聚焦后進入飛行時間檢測器。根據離子飛行時間的不同進行分析得出離子質荷比（m/z）和離子峰值，形成質量圖譜。不同的微生物由于蛋白分子組成有差異而形成具有特異性的圖譜，通過軟件對數據庫的比對進行微生物種或菌株的區分和鑒定。

質譜鑒定方法十分迅速，可以在數分鐘內完成微生物鑒定，有研究顯示MALDI-TOF MS與傳統方法比較降低了實驗室成本和出報告的時間，與傳統方法所需的數小時相比是一個質的飛躍。此外，質譜操作簡便，通量高，可以同時鑒定多個樣本。通常質譜數據庫是作為儀器的組成部分，由各自公司開發和維護，這一點有別于公共開放數據庫。質譜儀數據庫的可擴展性對于進一步的鑒定分析非常重要，尤其是菌種間的區分和流行病學研究等。由于不同的平臺都是在各自的系統中建立自身的數據庫并且發展自身的軟件、算法和評分標準，因此不同的質譜系統給出的數字信息不具備可比性。不同的質譜系統的比較要通過對微生物鑒定最終結果的準確程度來實現。

二、臨床常用的質譜儀

目前臨床常用的用于微生物鑒定的質譜儀包括法國生物梅里埃的Vitek-MS和德國布魯克公司的Biotyper。Vitek-MS最初來自日本島津公司推出的一款質譜儀Axima，其微生物數據庫SARAMIS由德國Anagnos Tec公司開發。Biotyper系統是布魯克公司獨立研發的產品。兩個系統的數據庫都是開放平臺，支持使用者添加和擴大數據。

MALDI-TOF MS是十分準確的細菌鑒定方法，培養的條件如培養基或者pH值的變化對檢測結果的影響很小，所以實驗室間可比性也很好。在已發表的大多數研究中，質譜分析出現錯誤報告的幾種原因為，數據庫自身不完整、數據比對或者采集時發生錯誤、質譜分辨率無法區分的相似菌種等。

三、質譜技術在臨床感染診斷中的應用

1. 臨床常見細菌的鑒定：2009年Seng等用1660株細菌對MALDI-TOF MS常規鑒定細菌進行前瞻性研究，結果顯示MALDI-TOF MS是一種經濟、快速、準確的常規細菌鑒定方法，未來有可能取代傳統的革蘭染色和生化方法。此后，MALDI-TOF MS在臨床應用迅速增加。在Medline數據庫用“MALDI tof bacteria identification”作為MeSH檢索詞，從2009至2013年1月發表相關文章467篇，其中2011至2013年發表323篇。由此可見MALDI-TOF MS近幾年在臨床微生物檢驗中備受關注。

另外，MALDI-TOF MS對彎曲菌、螺桿菌、軍團菌等苛氧菌、少見菌等的鑒定，解決了微生物實驗室對這類病原菌的鑒定、臨床對其感染的診斷和治療、流行病學資料缺失等的瓶頸問題。

2. 樣本直接檢測：應用MALDI-TOF MS直接鑒定陽性血培養標本中的細菌和真菌可以極大地提高檢測速度。大量的研究嘗試用不同的方法來處理血標本，由于血培養基各異、數據庫和分析軟件等差異都對樣本前處理的方法標準化造成了一定的困難。布魯克公司研發了血培養標本的前處理試劑盒，用于陽性血培養標本直接質譜鑒定的前處理。研究顯示革蘭陰性菌的準確率優于革蘭陽性菌，而對厭氧菌、α-溶血性鏈球菌和多個細菌混合樣本的鑒定存在困難。新的富集技術的應用（比如附加特異性抗體親和特定蛋白）以及相應分析軟件的改進，將使MALDI-TOF MS直接用于血液病原菌的檢驗成為可能，即MALDI-TOF MS作為一種快速、使用簡便，低成本消耗的檢測技術，有望取代傳統血培養檢測技術，為血培養中病原菌的快速診斷提供有力支持。此外，臨床的尿液和腦脊液標本也可以經一定處理后，用質譜技術進行蛋白譜的分析用于疾病的輔助診斷。

3. 真菌鑒定：有學者應用MALDI-TOF MS對327株菌（其中19株為酵母菌）在種的水平上鑒定正確率為61株為酵母菌）的鑒定正確率為92%。

4. 非結核分枝桿菌鑒定：國外學者對107株分枝桿菌臨床分離株（包括結核分枝桿菌復合體），利用聲波降解的熱失活方法和利用玻璃珠進行細胞裂解的方法進行失活和提取，再利用MALDI-TOF MS方法進行鑒定，發現兩種方法在種/屬水平上成功鑒定率分別為82.2%和88.8%。周昭彥等采用MALDI-TOF MS對83株非結核分枝桿菌（臨床分離非結核分枝桿菌15株和醫院供水系統環境分離非結核分枝桿菌68株）進行快速鑒定方法及其可行性、準確性和重復性進行研究，并得出結論認為MALDI-TOF MS可快速準確地鑒定臨床和環境分離的非結核分枝桿菌，在臨床實驗室常規鑒定方面有著較好的應用前景。

5. 質譜技術檢測病原菌耐藥性：除快速鑒定外，質譜技術也被嘗試用于檢測一些臨床常見的耐藥基因，例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌等的識別，鮑曼不動桿菌相關的耐藥機制與產生條件等，為控制耐藥菌株播散流行及治療提供新的策略。

質譜技術為臨床微生物實驗室提供了快速而準確鑒定細菌、分枝桿菌、真菌等的方法，其中臨床標本的直接鑒定成為未來研究的方向。將MALDI-TOF MS與全自動藥敏檢測儀相連，整合到實驗室自動化流水線后，可以提高檢測速度，縮短患者住院時間，提高療效，降低醫院和患者的經濟負擔。另外MALDI-TOF MS與其他分子生物學檢測技術聯合，可以對臨床產酶菌株的檢測方法、基因分型及測序、蛋白質組學方面開展更加深入的研究。MALDI-TOF MS有望成為臨床實驗室微生物鑒定分型等領域發展的重要方向。