質譜分析

實驗概要

本實驗在二維電泳圖像獲取和分析的基礎上，利用質譜分析及數據庫搜索鑒定部分蛋白質斑點。

實驗步驟

1. 膠內酶切隨機選擇重復性好，差異顯著，無明顯變形、拖尾，與周圍蛋白點分離明確的蛋白點作為質譜分析對象，進行膠內酶解。

   1) 從膠上切取蛋白質凝膠顆粒置入96孔培養板內，用去離子水清洗數次。

   2) 加50 ul脫色液[30 mmol/L potassium ferricyanide和100 mmol/L sodium thiosulfate 1：1]在室溫下震蕩至凝膠中棕黃色褪盡，棄去溶液；

   3) 去離子水洗滌，重復2次；

   4) 在室溫下震蕩10分鐘脫水，吸棄其中的ACN，重復2次；

   5) 加10ul/孔消化液(12.5 ng/ul胰蛋白酶和20 mmol/L NH₄HCO₃溶液，4℃吸脹30分鐘；

   6) 37^oC酶解12小時以上。

2. 抽提多肽：加50ul/孔肽提取液(( 0.1% TFA和50% ACN 1：1 )室溫震蕩30-40分鐘，收集肽提取液，置入新的96孔培養板內，真空干燥濃縮，備質譜分析用。

3. PMF數據采集取1ul凍干樣品加1ul基質(α-CHCA飽和溶解在0.1 % TFA-30% ACN-10%丙酮溶液中)混勻后取1ul點于靶上做質譜分析。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜( matrix assisted laser desorption/ioniz-anon time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS )分析采用反射模式，正離子譜測定，離子源加速電壓為20 KV，每一個肽圖譜由200次轟擊累加形成。采用Bruker公司肽混合標準品作外校正，胰蛋白酶自降解峰(m/z 842.50；m/z 2211.10 )作內校正。用Flex Analysis 2.0 C Bruker Daltonik，Bremen，Germany)軟件獲得PMF。

4. 肽序列數據采集4700 Proteomics Analyzer質譜儀使用Nd：YAG激光源，激光波長355 nm，脈沖200 Hz，離子源加速電壓為20KV，質量檢測范圍700-3，500 m/z。采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據。用Myoglobin酶解肽段作外標質量校正。用Data Explorer TMSoftware質譜分析軟件(知plied Biosystem公司產品)處理圖譜得到得到蛋白質PMF和肽序列數據。

5. 數據庫查詢登陸http：//www.matrixscience.com，用Mascot程序對獲得的PMF數據，進行數據庫檢索。將待測蛋白質的多個肽段質量數據與數據庫中已知蛋白質肽段質量數據進行比對。如果比對的結果有顯著相關性(P < 0.05 )，則蛋白質鑒定成功。檢索參數如下：

Type of search                Paptide Mass Fingerprint

Database                         NCBInr or SwissPort

Taxonomy                       Rattus

Enzyme                           Trypsin

Allow up to                     1 missed cleavages

Fixed modifications        Carboxymethyl(C)

Variable modifications   Oxidation(M)

Max Missed Cleavages   1

Peptide tol.                      土100PPM

串聯質譜獲得的肽段PMF和肽序列數據，通過GPS (AppliedBiosystems，USA)一MASCOT(Matrix Science，London，UK)在NCBInr數據庫中搜索。檢索方式為：combine。檢索參數設置：種屬為rattus；最大允許漏切位點為1；酶為胰蛋白酶。質量誤差范圍設置：PMF 0.3 Da，MS/MS 0.4 Da；手工剔除胰酶自降解峰和污染物質的峰。Mascot給出的大于95%置信水平的蛋白為鑒定成功的蛋白質。