質譜技術在肝臟疾病檢測中的研究進展

肝臟疾病是嚴重危害人類健康的疾病，其病因復雜多樣，既包括感染、腫瘤等常見因素，也包括自身免疫性、先天性疾病等特殊因素。臨床最常見的慢性肝病為乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染所致，在世界范圍內分別有3.7億和1.3億患者；慢性肝炎通常緩慢進展為肝纖維化和肝硬化，最終可能發展為肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，肝細胞癌死亡率很高，據世衛組織報道，每年全世界死于HCC的患者約為600 000人，而其中一半死亡病例發生在中國[1]。除了病毒感染外，藥物和毒物的損害，營養不良和嗜酒，以及代謝異常等因素也是肝臟疾病的主要原因。

慢性肝病的診斷對疾病的治療和預后具有重要的意義，目前對肝炎病毒感染的診斷，通常采用免疫學或分子生物學技術檢測病毒的特異性抗原、抗體或核酸片段，而腫瘤標志物及影像學技術對HCC的診斷也有廣泛的臨床應用。近幾年，隨著技術的發展和革新，質譜技術也開始廣泛應用于各個醫學診斷領域，如腫瘤標志物篩選、細菌鑒定、耐藥分析以及病毒檢測等，成為很多臨床實驗室的常規檢測技術[2]。

一、質譜分析技術發展狀況

雖然，世界上第一臺質譜儀在20世紀早期就已研制成功，但直到20世紀80年代，隨著基質輔助激光解析(Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)和電噴霧電離(Electrospray ionization，ESI)等"軟電離"技術的發展才使得質譜技術在生物醫學領域得到廣泛的應用。隨后，液質聯用技術，如LC–MS/MS的出現，則極大地推動了質譜技術在醫學檢驗領域的發展。目前應用較廣泛的質譜技術包括表面增強激光解析電離飛行時間質譜(surface–enhanced laser desorption/ionization–time of flight，SELDI–TOF–MS)和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix–Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI–TOF–MS)等，它們是新型的蛋白質組學研究技術，具有高通量和高速度的優勢，目前主要用于腫瘤及其他疾病標志物的篩選。但二者的靈敏度和重復性存在一定缺陷，嚴重制約了它們在臨床檢測中的應用。而且上述技術只能對目的蛋白或疾病標志物進行定性檢測，無法反映疾病的嚴重程度并對疾病進行預后判斷。近年新發展起來的包括核素標記定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術可對樣品進行蛋白質絕對和相對定量研究，具有分離能力強，分析范圍廣的特點，但是，對樣本要求高，樣本處理過程復雜及高試劑成本是該技術的主要缺陷。基于氣相色譜–質譜(Gas Chromatography–Mass Spectrometer，GC/MS)和液相色譜–質譜聯用(Liquid Chromatography –Mass Spectrometry，LC/MS)技術是目前常用的檢測方式，尤其是該技術在代謝組學中的研究價值受到學者的廣泛關注，代謝組學的研究對象大都是相對分子質量1 000以內的內源性小分子物質，通常采用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)，色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)等技術分離并檢測人體尿液或血漿等生物樣本中的代謝物譜圖，再結合模式識別方法，可以判斷出生物體的病理、生理狀態，并找出與之相關的生物標志物。相比較蛋白質組研究，代謝物分子檢測更加容易，并且種類少，更適合作為疾病的標志物。

二、質譜技術在病毒性肝炎檢測中的應用

HBV及HCV感染嚴重威脅著人類健康，目前臨床實驗室主要采用化學發光和核酸擴增技術進行病毒抗原、抗體和核酸的檢測。MassARRAY是基于MALDI–TOF–MS的核酸分析技術，已有學者將該技術用于HBV與HCV的血清分型，該方法的主要優勢是快速、廉價。另外，該技術可以檢測病毒的變異，區分野生株和突變株，指導臨床用藥，但缺點是只能用于HBV的B和C型[3]。

HBV突變可導致拉米夫定耐藥，目前主要檢測方法是測序，但耗時長，不適合大樣本量的檢測。Hong SP等采用MALDI–TOF–MS方法進行變異位點的檢測，具有更高的靈敏度和特異性，并且可以對HBV感染患者抗病毒藥物治療效果進行監測[4]。另外，對HCV分型的MALDI–TOF–MS方法也有不少文獻報道[5,6,7]。MALDI–TOF–MS技術也可用于其他抗病毒藥物耐藥的檢測[8]。

三、質譜技術在肝纖維化及肝硬化檢測中的應用

肝臟活組織檢查是診斷肝纖維化的金標準，但該方法是有創性檢查，患者依從性差，因此臨床迫切需要尋找簡單且易推廣的無創性診斷指標用于評估肝纖維化。目前對肝纖維化的無創性診斷方法主要包括影像學和血清學指標，而質譜技術在尋找新的無創性診斷指標中發揮了很大的作用。Poon的研究組應用SELDI–TOF MS技術尋找與肝纖維化分期相關的蛋白指紋峰，并利用差異蛋白峰建立了神經網絡(Artificial Neural Network，ANN)診斷模型，發現了5個蛋白峰(m/z為5905, 5928, 5948，3162，3267)與Ishak纖維化評分顯著相關，ANN模型指數與纖維化評分呈顯著相關性(r＝0.831)，并且其對肝硬化的預測正確率可到達89%，對Ishak>4的纖維化患者預測靈敏度可達100%[9]。Marfà等最近報道采用色譜和SELDI–TOF MS技術發現了一個5.9KDa的多肽具有肝臟早期纖維化的診斷價值，隨后證實為纖維蛋白原α鏈的C末端片段[10]。

四、質譜技術在酒精性肝病檢測中的應用

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是由于長期大量飲酒所導致的肝臟疾病。ALD的診斷是基于綜合臨床特征的，包括明確的飲酒史、肝病臨床證據和血清異常指標的支持。但常用的實驗室檢測指標在ALD診斷中的靈敏度和特異度均不能滿足臨床的需求，因此研究ALD的特異性診斷指標具有重要的現實意義。然而，由于酒精性肝病與其他類型肝病在患者機體生理變化上極其相似，所以尋找ALD特異性的標志物非常困難。Nomura的研究組早在2004年就采用質譜技術進行了這方面的探索，他們的思路是通過對酒精依賴癥患者血清中的差異蛋白進行分析，試圖找到具有診斷價值的ALD標志物，他們發現在慢性酒精依賴患者血清中纖維蛋白原aE片段和Apo AII以及色素上皮衍生因子(PEDF)都可能成為酒精依賴的特異性標志物[11,12]。另一個研究思路是通過對成人酒精攝入前后血清中蛋白質的變化來尋找酒精代謝的標志物，如Liangpunsakul等[13]采用MALDI–TOF–MS技術對16例志愿者飲酒前后的血清蛋白質譜進行比較，發現一個59 000的蛋白質在飲酒后發生了顯著改變，經鑒定該差異蛋白為α–纖維蛋白原，并認為該蛋白可以作為ALD的特異性標志物。

另外，部分學者通過建立酒精依賴的動物模型，通過質譜檢測發現了部分具有ALD診斷價值的蛋白質或代謝物分子，如Zhang L等采用蛋白質組學技術對酒精誘導的小鼠模型進行蛋白差異分析，他們提取了肝細胞的胞漿膜，并用雙向技術和iTRAQ技術分別進行檢測，結果共有15個不同的蛋白被檢測出來，其中，角蛋白–8被在兩種不同的方法中均被檢測出有意義，他們認為該分子可能在酒精對肝臟的損害中發揮一定的作用[14,15,16]。

五、質譜技術在肝細胞癌檢測中的應用

HCC是常見且致死率高的惡性腫瘤，目前臨床使用的甲胎蛋白(alpha–fetal protein，AFP)一直是HCC診斷的重要指標，但AFP診斷HCC的靈敏度只有39%～65%，無法滿足早期診斷和預后判斷的要求，因此研究新的血清學標志物具有重要的意義。

2003年Poon的研究組采用SELDI–TOF–MS技術比較慢性肝病組(chronic liver disease，CLD)和HCC患者的血清蛋白指紋圖譜，并根據差異蛋白建立了神經網絡預測模型。他們發現m/z為8944和8811的蛋白峰在兩組之間具有顯著性表達差異，并且與腫瘤轉移有關，ANN模型可到達90%的特異性和92%的靈敏度[17]。Liu C等采用MALDI–TOF–MS技術對60例HCC患者，36例其他肝病患者和46名性別年齡匹配的正常人的血清蛋白質譜進行比較，他們發現4471、8936、11670和13752 m/z的蛋白峰具有HCC鑒定的特異性，采用決策樹建立診斷模型，其AUC可達到0.927[18]。Xiao等[19]采用超高效親水性液相色譜與電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜聯用法(Performance Liquid Chromatography–Quadrupole Time of Flight–Mass Spectrometry，UPLC–QTOF–MS)技術對HCC患者和肝硬化患者血清小分子代謝產物差異進行比較，最終，甘氨膽酸(glycocholicacid，GCA)，甘氨脫氧膽酸(glycodeoxy–cholic acid，GDCA)等代謝產物被發現在HCC組和肝硬化組有顯著差異性，有望成為新的HCC診斷標志物。

六、展望

生物質譜技術具有高通量、快速等特點，因此在生物大分子研究領域得到了廣泛應用，目前很多具備條件的臨床實驗室也開始引進質譜儀用于臨床樣本的檢測[20]，例如MALDI–TOF–MS已成功進入臨床微生物實驗室，成為細菌鑒定領域突破性的技術。在肝病的診斷中，生物質譜技術具有很好地發展前景，通過質譜技術有可能發現一些靈敏度高和特異度好的肝病分子標志物，可極大地提高目前的肝病診斷水平。

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