質譜技術在蛋白組研究中的應用（一）

[摘要] 質譜對于現代蛋白質化學研究是一項重要的技術。也可用于蛋白組分析,在同一時間監控上千種蛋白的表達情況。首先蛋白質混合物可以用雙向凝膠電泳分開，再用質譜及隨后的蛋白質數據庫檢索對單個蛋白進行鑒定和分析。最近幾年，質譜領域取得了令人鼓舞的進展，使得全自動、高通量的蛋白檢測成為可能。質譜也可以用來分析蛋白的轉錄后調節以及研究蛋白質復合體。本文將介紹目前蛋白組研究中質譜方法的應用并對其優缺點進行討論。 

關鍵詞: 質譜；二維電泳（2-DE）；蛋白組分析MALDI-TOF 



1 前 言 



蛋白組學是研究生物特定組織或細胞內表達的所有蛋白質成分，蛋白質組的一門學科。蛋白組分析一般是用雙向凝膠電泳（2-DE），質譜（MS）以及數據檢索來完成。2-DE要回顧到20世紀70年代初[1],但是用質譜技術對蛋白質進行鑒定和分析是在近十年內才成為可能。其中最重要的一個原因是新的軟離子技術即基質輔助激光解析電離（MALDI）[2]和電噴霧電離（ESI）[3，4]技術的發展和應用，以及樣本制備技術和質譜儀的發展等。從數據庫中獲得成指數上升的序列信息也促進了質譜技術的發展。 

跟轉錄組學中的全自動DNA微陣列技術相比，蛋白組分析需要更多的手工操作，尤其在2-DE上會出現很多問題[5，6]。盡管存在很多困難，蛋白組學的重要性還是公認的。DNA微陣列技術是建立在對mRNA穩定水平的檢測上，然而蛋白組學研究的對象是細胞中最活躍的因子——蛋白質。最近有研究證明，mRNA的表達和蛋白的水平并非具有相關性[7，8]。蛋白質有轉錄后修飾過程，并會以不同的形式出現。而這些修飾過程是相應的DNA測序技術所不能預測的。質譜技術在蛋白質修飾分析過程中具有重要的作用。 



2 質譜對蛋白質的檢測 



質譜儀是由離子源，質量分析，離子檢測器，以及數據檢索等單元組成。首先，被分析的分子在離子源中被離子化，然后在質量分析器里根據不同的質荷比分開，再對分開的離子進行檢測。隨著MALDI和EIS的出現，質譜技術已經廣泛用來分析蛋白質。質量分析器有很多種，最常用的方法是將飛行時間檢測器（TOF）與MALDI或三級四級串聯質譜儀聯用，或者將四級桿-TOF，離子阱等連接到ESI上。 

蛋白組分析中，可以用兩種不同的方法檢測電泳分離后的單個蛋白質。最簡單的方法叫做肽指紋譜測定（PMF）[9～13]。這個方法是用特殊的酶對2-DE分離后的蛋白質點進行降解，產生的肽從凝膠中分離出來后再用質譜分析和檢測肽的分子量。數據庫檢測能夠產生所有蛋白質理論上的PMF，把它們和質譜分析所獲得的肽片進行比較就可以得出結果。第二種方法是在質譜儀中把凝膠分離后的肽分解成片段，產生局部的氨基酸序列（序列標簽）。那么就可以用分子量或者序列信息進行數據庫檢索[14，15]。PMF一般用MALDI-TOF來實現，序列標簽可以用串聯質譜技術MS-MS進行檢測[16～18]。用質譜檢測蛋白的靈敏性可以精確到飛摩的水平，甚至已有報道其精確度可以達到阿摩水平[19]。 



3 用MALDI-TOF進行肽指紋譜分析 



凝膠分離后的蛋白質鑒定以及肽指紋譜分析是目前質譜實驗室常規使用的方法。在進行MALDI分析之前需要最優化的凝膠上消化[20～22]和脫鹽過程。胰島素是最常用的凝膠消化酶，因為它在賴氨酸和精氨酸位點能夠特異性切割蛋白質，產生分子量在600～2500Da之間的小分子肽，并能夠從凝膠上有效的分離出來。 

MALDI-TOF是質譜技術中相對簡單并很容易使用的一種方式，對樣本中的鹽和其他污染物有很高的耐受性，這點優于ESI。提取的肽片混合物中較小的片段可以直接沉積在靶板上做PMF分析，剩下的樣本可以儲存起來作為以后的ESI-MS分析。如果經凝膠分離后所有的肽全用來做MALDI分析，那么樣本經脫鹽以后將會取得更好的結果。脫鹽的過程可以用商品化的試劑盒ZipTip(Millipore)，或者在凝膠電泳儀的末端放置一個小的逆向塑料柱來實現[23,24]。 

PMF中非常重要的一個因素就是質譜測量分子量的準確度[25]。現代的MALDI-TOF儀都具有延遲取樣反射器裝置，用它們檢測的肽段分子量可以精確到10～30ppm。這樣的精確度使得4～5個肽段足以清楚的鑒定蛋白質的分子量。MALDI產生的大多數都是單電荷離子，所以它的圖譜很容易解釋。 



4 肽質指紋譜分析的自動化 



為了實現高通量蛋白檢測，樣本準備，質譜檢測，資料分析和數據檢索必須實現自動化操作。目前有些實驗室用機器人對蛋白質進行自動化取點，凝膠上消化，樣本脫鹽以及對MALDI平板進行定點測定等。而且，現代化的MALDI-TOF儀完全能夠讓MALDI檢測自動化。資料分析和數據檢索過程同樣可以自動化。在進行蛋白組分析時，如果在凝膠上不用單個分離就可以對所有蛋白質進行鑒定將是非常具有誘惑力的。為此，研究人員做了很多努力，由Hochestrasser及其同事建立了一套稱作分子探測術的方法（molecular scanner）[26，27]。它是將整個2-ＤＥ膠上蛋白質樣本同時酶解,并將酶解片段一起原位轉移至另一張膜上,再直接用ＭＡＬＤＩ－ ＴＯＦ 質譜對膜上樣本進行整體掃描,為實現蛋白質組學研究的自動化、規模化以及臨床應用提供了一個嶄新的思路和方法。這種思路的優點是顯而易見的,不過按照目前的方法,要普及此種技術主要的難點是,質譜掃描一張圖譜所需的時間過長,如用0.4ｍｍ的精度掃描一張4ｃｍ×4ｃｍ的膜需55個小時,這就意味著一張16ｃｍ×16ｃｍ的常用膜的掃描,至少需要36天不間斷的工作和大約40Ｇ的磁盤空間存儲如此龐大的原始數據。 



5 用ESI-MS/MS的方法創建序列標簽 



只有當被消化的蛋白存在于已有的蛋白或基因組數據庫中，并且能從MALDI分析器中得到四五個肽片的數據才能成功進行。如果在EST數據庫中只有目的蛋白的部分序列，那么就需要知道肽片的序列信息。創建序列標簽的優勢在于，用肽的分子量和序列作為數據庫檢索對象比只用分子量作為檢索對象具有更高的特異性。有了序列標簽信息后，也可以用EST數據庫進行檢索[28]。通常來自于一個肽上的序列標簽就足以鑒定蛋白質。同MALDI相比，納升-ESI-MS/MS費時費力，而且在做ESI分析之前必須對樣本進行脫鹽處理。這些問題可以通過ESI-MS與HPLC聯用得到解決。做ESI分析對樣本濃度很敏感，用現代化的納升-HPLC方法可以提供很高的局部肽片凝聚物，分離后的樣本可以直接用于質譜分析，而不需要再分解。當分析混合物的時候，在質譜之前做LC分離尤其重要，因為它使得數據依賴的實驗（DDE）成為可能,在DDE中，所有的離子都進入檢測器進行測量，如果從HPLC到質譜之間出現一個峰的話，軟件將自動從質譜轉換到MS/MS模式并對產生的離子進行掃描。跟納升-ESI相比，用這個方法可以從一份標本產生更多的MS/MS數據。Yates等已經詳細敘述了如何進行LC-MS/MS全自動蛋白檢測的策略[29]。