6 質譜儀的最新進展
用質譜檢測蛋白，首先考慮到用PMF與
MALDI-TOF聯用，如果無法檢測，下一步就用ESI-MS/MS創建序列標簽。在PMF分析中，MALDI的平板中只需一小部分樣本就足以檢測，剩下的樣本就可以用來創建序列標簽。并且，在MALDI-TOF儀器上，用一種叫做“源后延遲”的方法可以對只有部分序列的肽段進行檢測。然而，用這個方法產生的質譜圖比較難說明，精確性也很差。最近，用MALDI聯合四級桿-時間質譜分析器[30，31]以及原始的MALDI-TOF/TOF[32]方法產生了。因此同一份標本可以首先考慮用PMF檢測蛋白[33]，如果有必要的話，再用MS/MS創建序列標簽。MALDI聯合四級桿-TOF檢測高通量蛋白是有希望的[31]。
7 蛋白質組研究中的轉錄后修飾分析
蛋白組分析很重要的一點就是能對蛋白表達水平以及轉錄后修飾，如磷酸化和糖基化進行研究。蛋白質的磷酸化是很有趣的，因為在信號轉導途徑中它扮演了重要的角色。
最早檢測蛋白質表達水平的方法是進行2-DE之前用35S-Met對樣本進行代謝性標記，再在2-DE上進行放射自顯影[34-36]。在凝膠中，不同蛋白的磷酸化和糖基化位點通常在凝膠中顯示一連串蛋白質點，但是還需要做更詳細的分析來確定修飾類型。蛋白質磷酸化的改變既可以用32P標記細胞，也可以用特異性磷酸化抗體做western
blotting進行研究。如果用32P標記的方法，仍然需要做2-DE。經過凝膠比較后，把感興趣的點從膠上切下來，然后用質譜鑒定[36]。Soskic使用的是印跡法，兩個2-DE同時進行，一個用于做特異的磷酸化抗體實驗，另一個做常規染色。蛋白質磷酸化和糖基化更為詳細的特性可以用質譜來檢測，但是需要更多的起始材料而不僅僅是二維凝膠上的一個點。另外這些分析不能產生直接的序列信息，技術上也比用質譜檢測蛋白要難的多。在蛋白上查找磷酸化位點有很多種方法。為了檢測消化后的混和肽中哪一個是磷酸化的，可以用MALDI-MS在磷酸化前后對混合肽做PMF分析：經過磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽將會失去一個磷酸基團，分子量將比處理前小80Da.
糖基化研究中，多聚糖從蛋白中釋放出來，對多聚糖結構的檢測就是從這些游離的多聚糖中得到的。一般把MALDI儀和外源性糖苷酶[37-40]聯合使用進行檢測。如果需要更為詳細的信息，可以用ESI-MS聯合使用前體離子掃描儀[41-44]。到目前為止，能夠用電泳分離后的蛋白進行糖蛋白結構檢測的報道很少。其中有一項研究是N端糖蛋白酶切以后用一維SDS-PAGE分離，然后用MALDI-MS以及外源性的糖苷酶進行結構分析[45]。
8 用質譜研究蛋白-蛋白之間的作用
經典的蛋白組學著重于研究蛋白質在何時何處表達。因為大部分的細胞功能都是由蛋白質復合體而不是由單個蛋白來執行的，所以鑒定蛋白質的成分和相互作用是非常重要的。這個過程可以用生物化學方法純化蛋白質后用質譜來鑒定不同的成分，如人類剪接體的成分，酵母的核孔復合體[46]以及核蛋白體等都可以用此策略檢測出來。
一般的蛋白復合體是用親和層析的方法純化和分離，如免疫沉淀反應[47，48]。
DNA結合蛋白可以用同它們有特異性親和力的核酸來分離，然后用質譜來鑒定[49]。Rigaut等人在串聯層析的基礎上，建立了一種通用的蛋白質復合體純化方法[50]。在這個方法中，一種TAP標簽和靶蛋白融合在一起，然后把蛋白轉移到宿主細胞或者組織中，融合蛋白在宿主細胞和組織中能持續表達。TAP標簽包括一種A蛋白和一種鈣調蛋白，在標簽之間有一個TEV蛋白酶切位點。用串聯親和層析法能將融合蛋白及與它相互作用的蛋白成分從細胞提取物中有效的分離，純化出來。Rappsiber等人分別用親和層析，交叉耦合以及質譜等方法[51]對酵母的核孔復合物Nup85p的親和性進行研究。經過層析以后，用一維SDS-PAGE方法就可以分離蛋白復合體中的各個成分，因此二維電泳的不足之處就可以避免。同樣也有可能直接用LC-MS方法分析大分子量蛋白質復合體[52]。
蛋白組分析的優越之處主要是用于蛋白和蛋白之間的相互作用以及蛋白的轉錄后修飾的研究，同時也可以用于基因表達水平的研究。質譜對于蛋白組分析來說是一項非常重要的技術，近年來儀器以及數據庫軟件的發展使得質譜成為能力更強大的工具。
參考文獻
[1] O’Farrell PH. J Biol Chem,1975,250:4007–4021.
[2] Karas M, Bachmann D, Bahr U, et al. Int J MassSpecrom Ion Process,1987,78:53–68.
[3] Meng CK, Mann M, Fenn JB. et al. Atoms, Mol Clusters,1988,10:361–368.
[4] Fenn JB, Mann M, Meng CK, et al.Science,1989,6(246):64–71.
[5] Corthals GL, Wasinger VC, Hochstrasser DF, et al.Electrophoresis,2000,21:1104–1115.
[6] Celis JE, Kruhoffer M, Gromova I, et al. FEBS Lett,2000,480:2–16.
[7] Anderson L, Seilhamer J. Electrophoresis,1997,18:533–537.
[8] Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, et al. Mol Cell Biol,1999,19:1720–1730.
[9] Henzel WJ, Stults JT, Wong SC, et al. ProcNatl Acad Sci USA,1993,90:5011–5015.
[10] Mann M, Hojrup P, Roeppstorff P. Biol Mass Spectrom,1993,22:338–345.
[11] Pappin DJ, Hojrup P, Bleasby AJ. Curr Biol,1993,3:327–332.
[12] James P, Quadroni M, Carafoli E, et al. Biochem BiophysRes Commun,1993,195:58–64.
[13] Yates JRD, Speicher S, Griffin PR, et al. AnalBiochem,1993,214:397–408.
[14] Mann M, Wilm M. Anal Chem,1994,66:4390–4399.
[15] Eng JK, McCormack AL, Yates JR. J Am Soc Mass Spectrom,1994,5:976–989.
[16] Wilm M, Mann M. Int J Mass Spectrom Ion Process,1994,136:167–180.
[17] Wilm M, Shevchenko A, Houthaeve T, et al. Nature 1996;379:466–469.
[18] Wilm M, Mann M. Anal Chem,1996,68:1–8.
[19] Morris HR, Paxton T, Panico M, et al. JProtein Chem,1997,16:469–479.
[20] Rosenfeld J, Capedeville J, Guillemot JC, et al. AnalBiochem,1992,203:173–179.
[21] Shevchenko A, Wilm M, Mann M. Anal Chem,1996,68:850–858.
[22] Pandey A, Andersen JS, Mann M. Science’s STKE: www.stke.org/cgi/content/full/OC–sigtrans;2000/37/pl1.
[23] Kussmann M, Nordhoff E, Rahbek-Nielsen H, et al. J Mass Spectrom,1997,32:593–601.
[24] Gobom J, Nordhoff E, Mirgorodskaya E, et al. J Mass Spectrom,1999,34:105–116.
[25] Clauser KR, Baker P, Burlingame AL. Anal Chem,1999,71:2871–2882.
[26] Binz PA, Muller M, Walther D, et al. Anal Chem,1999,71:4981–4988.
[27] Bienvenut WV, Sanchez JC, Karmime A, et al. Anal Chem,1999,71:4800–4807.
[28] Neubauer G, King A, Rappsilber J, et al. Nat Genet,1998,20:46–50.
[29] Yates III JR, Carmack E, Hays L, et al. MethodsMol Biol,1999,112:553–569.
[30] Loboda AV, Krutchinsky AN, Bromirski M, et al. Rapid Commun Mass Spectrom,2000,14:1047–1057.
[31] Shevchenko A, Loboda A, Schevchenko A, et al. Anal Chem,2000,72:2132–2141.
[32] Medzihradszky KF, Campbell JM, Baldwin MA, et al. Anal Chem 2000,72:552–558.
[33] Krutchinsky AN, Zhang W, Chait BT. J Am Soc Mass Spectrom,2000,11:493–504.
[34] Nyman TA, Matikainen S, Sareneva T, et al. Eur J Biochem 2000;267:4011–4019.
[35] Celis JE, editor. Cell Biology: A Laboratory Handbook, vol. 4,2nd. Academic Press, 1998,375–385.
[36] Gerner C, Frohwein U, Gotzmann J, et al. J Biol Chem,2000,Sep 7 [epubahead of print].
[37] Colangelo J, Orlando R. Anal Chem,1999,71:1479–1482.
[38] Geyer H, Schmitt S, Wuhrer M, et al. Anal Chem1999;71:476–482.
[39] Harvey DJ. Mass Spectrom Rev,1999,18:349–450.
[40] Nyman TA, Kalkkinen N, et al. Eur J Biochem,1998,253:485–493.
[41] Sheeley DM, Reinhold VN. Anal Chem,1998,70:3053–3059.
[42] Reinhold VN, Reinhold BB, Costello CE. Anal Chem,1995,67:1772–1784.
[43] Kuster B, Hunter AP, Wheeler SF, et al. Electrophoresis,1998,19:1950–1959.
[44] Rout MP, Aitchison JD, Suprapto A, et al. J Cell Biol,2000,148:635–651.
[45] Yamaguchi K, Subramanian AR. J Biol Chem ,2000,275:28 466–28 482.
[46] Yamaguchi K, von Knoblauch K, Subramanian AR. J BiolChem,2000,275:28 455–28 465.
[47] Rotheneder H, Geymayer S, Haidweger E. J Mol Biol,1999,293:1005–1015.
[48] Boehning D, Joseph SK. EMBO J,2000,19:5450–5459.
[49] Nordhoff E, Krogsdam AM, Jorgensen HF, et al. Nat Biotechnol,1999,17:884–888.
[50] Rigaut G, Shevchenko A, Rutz B, et al. Nat Biotechnol,1999,17:1030–1032.
[51] Rappsilber J, Siniossoglou S, Hurt EC, et al. Anal Chem2000;72:267–275.
[52] Link AJ, Eng J, Schieltz DM, et al. Nat Biotechnol,1999,17:676–682.
T.A. Nyman /Biomolecular Engineering, 2001:18 .221–227.