質譜樣本制備技術資料

試劑耗材：

Milli-Q water、Non-powder gloves、Face mask、Hat、10μl and 200μl tips（eppendorf）、Menthol(Fisher M/4056/17)、Acetonitrile(Fisher A/0626/17)、Trypsin (Promega V528)、Trypsin resolve solution(Promega V530)、Ammonium bicarbonate（Sigma A6141）、ZipTip μC-18（Millipore ZTC18M096）、TFA(GE HealthCare)、0.2ml and 0.5ml EP tube(eppendorf)、50ml EP 0.5ml EP（Corning）

用具儀器：

真空干燥儀、水浴鍋、10μ和200μ移液器、廢液缸、制冰和裝冰設備、200μ管架、剪刀、能裝放置了200μ管管架的塑料盒、200μ管離心機。

準備：

1. 0.2ml EP管三套，MilliQ水和甲醇各涮一遍，真空干燥。

2. 50ml EP管六支，MilliQ水和甲醇各涮一遍，真空干燥。

3. 胰酶儲液制備：使胰酶粉末沉落瓶底，用100μ胰酶重旋液溶解，用0.5ml EP分裝成5μl。

4. 50ml 100 mM NH4HCO3。

脫色酶切：

1. 切點將200μl tip頭剪成吸口1.5mm左右的直徑，MilliQ水涮洗一遍，吸100μl水后戳取斑點，將膠粒打入0.2ml EP管中，吸干水后再用MilliQ水洗滌兩遍，吸干。

2. 脫色 180μl 50%MeOH/50mM NNH4HCO3脫色兩次以上，每次半小時；180μl MilliQ水洗滌5分鐘，180μ 50% ACN洗滌5分鐘，180μl 100%ACN洗滌5分鐘；真空干燥半小時。

3. 酶切

① 25 mM NH4HCO3稀釋胰酶至12.5μg/μl；每管膠粒加入胰酶3μl，冰浴15分鐘后洗掉多余的胰酶；再加入3μl左右25 mM NH4HCO3至覆蓋膠粒。

② 小心將EP管倒轉，將整個EP管架放入塑料盒中后放入37度水浴鍋酶切16小時。

③ 將塑料盒從37度水中撈出，注意不要倒掉水，冷卻至室溫。

④ 加入10μl 25 mM NH4HCO3，震蕩15分鐘，離心后收集至新管；

加入10μl 2.5%TFA，震蕩5分鐘，收集至上管；

加入10μl 2.5%TFA-50% ACN，震蕩5分鐘，收集至上管；

加入10μl 100% ACN，震蕩5分鐘，收集至上管。

⑤ 將此收集液真空濃縮至5-10μl后，加入20μl 0.5%TFA；繼續濃縮至10-20μl。

肽段濃縮除鹽：

1. 吸10μl 100% ACN，棄之，重復兩次；

2. 吸10μl 0.1% TFA，棄之，重復兩次；

3. 吹吸樣本15次；

4. 吸10μl 0.1% TFA，棄之，重復兩次；

5. 吸3μl 0.1% TFA-50% ACN，將此洗脫液轉入新EP管。