離子回旋加速器與軌道離子阱質譜儀
隨著功能強大的帶有外部離子源的傅里葉變換-離子回旋加速器(FT-ICR)質譜儀的出現以及商業化，我們在質譜儀的分辨率與準確性方面取得了質的飛躍。有了這種新型的質譜儀，我們現在可以對ppm級乃至亞ppm級的樣品進行分析了。該質譜儀的高分辨率特性不僅提高了數據結果的質量，同時也增加了峰容量(peak capacity)，因此相比傳統的低分辨率質譜儀，FT-ICR質譜儀能夠獲取更多的信息。配有外部LIT設備的“雜交” FT-ICR質譜儀(hybrid FT-ICR instrument)的發展更是提高了該質譜儀的分析能力，同時也賦予傳統的低分辨率MS/MS質譜儀更好的探測母離子的能力。將FT-MS質譜儀與LIT-ICR“雜交”質譜儀結合，就能獲得真正意義上的平行全質譜檢測儀(parallel full mass spectrum)MS1和串聯(而非連續)質譜儀(tandem not sequential mass spectrum)MS2。高質量的MS1檢測結果可以用于定量研究。這種策略唯一的缺點就是相對比較低的數據采集速度(平均每個循環只能獲得幾個數據)和IT設備造成的動態范圍較窄。
最近，出現了一種新型的軌道離子阱(orbitrap)質譜儀。這是30年來上市的第一款使用最新物理技術的質譜儀，該質譜儀能分離振蕩電場(oscillating electric field)中的離子。在分辨率和準確率方面軌道離子阱質譜儀與FT-ICR質譜儀不相上下，但是它不需要FT-ICR質譜儀使用的昂貴的超導磁鐵(superconducting magnet)。
MS - MS 操作模式
串聯質譜儀通常使用的都是離子模式來鑒定蛋白質的氨基酸序列(圖1A)。目前所有的MS/MS質譜儀都具有該功能。不過表1中列舉的其它特殊的質譜儀也具有MS/MS功能。如果要發現蛋白質中的某個功能基團則需要用到母離子掃描功能或者中性丟失掃描功能，而這就必須用到三重四級桿質譜儀，如，Q-Q-Q質譜儀，或四級桿離子阱質譜儀，如，Q-Q-LIT質譜儀。比如復雜混合物里的蛋白質磷酸化位點和糖基化位點就都可以用這種方法(在碰撞池中產生特殊的報告離子，通過它來進行特殊的功能檢測) 檢測出來。在一個典型的質譜檢測試驗中，首先先用母離子掃描或中性丟失掃描都能發現目標組分，然后再用傳統的MS/MS方法鑒定蛋白質的氨基酸序列以及定位修飾位點。
三重四級桿質譜儀在MRM模式下也能以極高的敏感度進行定量分析。已知的或未知的分析物都以極高的敏感度和選擇性能被定量檢測出來(圖1D)。這種高選擇性得益于質譜儀能夠對代表一個肽段的一對母離子和片段裂解物離子進行實時監測。而且，在MRM模式下進行的兩輪選擇過程會極大地提高檢測的靈敏度，因為，第一輪篩選過后只能剩下很少的離子，這也就將背景噪聲減小到了最低水平。碰撞誘導解離片段離子(collision-induced dissociation fragment ions，CID)來源于母離子，這些CID離子能夠產生離散信號，而背景化學噪聲信號則是隨機分布的。最后，由于這種采樣時間很長的技術固有的非掃描本質使得它的敏感度非常高，相比離子掃描技術的探測極限(LOD)要高出好幾個數量級。
質譜儀的性能
我們已經在表1中對各種質譜儀的性能進行了一個概括。總體來說，質譜儀的性能包括分辨率、敏感度或探測極限和準確性等，這些性能都與質譜儀的類型、采用的離子化方法和掃描能力有關。不過沒有哪一個儀器能同時在上述所有方面都全面占優，在選擇儀器的時候必須根據實驗需要進行相應的取舍。
對實驗儀器性能的比較一直以來都是一個存在很多爭議的話題。因為性能是服務于需求的，是取決于待測樣品和實驗步驟的。質譜儀對單獨肽段樣品進行檢測時敏感度總是很低，不過如果生物樣品的基質背景(matrix background)很高，那么檢測的敏感度就會提高好幾個數量級。這種同一款儀器在性能上表現出來的“不穩定性”其實很常見，在儀器處于不同操作條件或狀態下時(比如 ， 在最優條件下，常規條件下和大批量處理條件下) 它們的性能表現都是不同的。實驗目的是：想進行定量分析還是蛋白質鑒定，這也決定了該使用哪種儀器。在蛋白質鑒定試驗中，儀器的分辨率(能很好地區分不同組分) 和準確性是最主要的，而在定量研究中，敏感度、動態范圍和MRM能力才是最主要的。因此，我們應該根據實驗目的的需要以及實驗設計安排來確定該使用哪種質譜儀。
要想用全掃描模式(full scanmode)獲取定量數據的同時再用MS/MS模式獲取定性數據是一件非常困難的事情。不過某些“雜交”質譜儀，比如LIT-ICR質譜儀，由于它們能夠平行采集數據，因此可以部分解決上面那個問題。精確的定量分析需要源自整個洗脫圖(entire elution profile)的高質量的、高信噪比的數據信息。數據質量與數據采集參數高度相關，這些數據采集參數包括掃描時間或者采樣時間(對于非掃描質譜儀而言)。因此，我們經常需要在數據質量和樣品處理能力(量)之間做出取舍。
最新進展
最近又有幾項有關質譜儀的最新進展問世，這些新成果的出現又給我們的生物大分子研究工作補充了“彈藥”。在蛋白質測序方面，基于碰撞誘導裂解技術(CID)，又新出現了可變裂解技術(Alternate fragmentation technique)，該新技術是基于處在碰撞池中的離子具有的電子傳遞特性開發出來的。目前，電子捕獲解離技術(ECD)和電子傳遞解離技術(ETD)都已經分別被應用到FT-ICR質譜儀和LIT質譜儀上了。運用這兩種技術產生的蛋白質裂解產物能與經典的CID方法裂解產物互為補充。不過這兩種新方法裂解更均勻，更適合用于發現翻譯后修飾情況。ECD技術和ETD技術還都可以用于大型肽段和蛋白質的研究。他們的裂解能力和對完整蛋白的分析能力可以幫助我們直接用質譜儀對完整的蛋白質進行分析，即可以采用所謂的“自上而下(top-down)”的方法進行研究。這樣，我們能夠獲得完整的氨基酸序列信息和翻譯后修飾信息，能夠對蛋白質進行最準確的鑒定。
傳統的和最新的蛋白質組學研究策略
雖然到目前為止，還沒有一種蛋白質組學研究策略能夠對某個蛋白質組進行常規的、完整的分析，但是現在的技術已經非常強大，我們相信，很快就能進行全蛋白質組學研究了。而且，對某個亞蛋白質組(比如某個細胞器或亞細胞結構的蛋白質組)進行研究早就已經不是什么難題了，這已經成為了一種常規的研究手段。不過，蛋白質組學研究方法也需要視研究目的而做出相應的調整，不能千篇一律，比如，有很多研究都是描述性的研究項目，主要的關注點都著眼在發現、鑒定出蛋白質以及這些蛋白質的翻譯后修飾情況，而最近又開始逐漸興起蛋白質組學定量研究了。
實際上，每一個以質譜檢測為基礎的蛋白質組學研究工作都包括以下3大部分：(i)分離、消化蛋白質樣品，然后對樣品進行進一步裂解;(ii)對樣品進行質譜定性和定量檢測;(iii)用相應的軟件對質譜檢測結果進行分析處理，獲得蛋白質的氨基酸序列，并且如果可能的話，進行定量分析。蛋白質的鑒定工作主要由MS-MS質譜儀負責，然后通過將質譜檢測結果與數據庫中的數據進行比對，最后確定出蛋白質的氨基酸序列。需要提醒的是，對結果的統計分析工作是保證結果正確性的關鍵。
對純化蛋白進行質譜分析
下面，我們用最“古老”的蛋白質組學研究方法——2維凝膠電泳法(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)結合質譜分析法對純化蛋白進行質譜分析的策略為例進行介紹(圖2A)。首先，待測目標蛋白經消化、酶解之后經由質譜儀進行鑒定，通常使用的都是MALDI-ToF質譜儀來獲取肽鏈指紋圖譜(peptide mass fingerprint)。最近，出現了好幾種該策略的改進方法，即將各種連續電泳分離方法(sequential electrophoretic separation method)或色譜分離方法(chromatographic separation method)結合進來，以提高質譜檢測時的峰容量，這樣就提高了對復雜樣品的分辨率。定量分析則是在蛋白質水平通過比較不同樣品中目標蛋白的信號強度來完成的。這種策略的優劣取決于它們區分相關(近)蛋白質的能力，即分辨率的高低，比如要能夠區分出經不同類型修飾的蛋白質，還取決于待測樣品的復雜程度。這種研究策略最大的問題是動態范圍太窄，而且處理樣品的能力也不夠高，不具備高通量分析的功能，因此不足以進行蛋白質組學研究。而且，一些比較重要的蛋白質，比如膜蛋白等還不能用該方法進行分析，因為該方法只能用于分析復雜度比較低的樣品，或者用于對某一特定蛋白進行分析的實驗。
對復雜樣品進行質譜檢測
對復雜樣品進行質譜檢測時也用到了人類基因組研究項目中用到的“鳥槍法”策略。即首先將蛋白質組樣品進行裂解，這樣獲得的多肽片段才能夠用于自動化MS/MS分析，我們常用的是快速掃描設備如IT質譜儀(圖2B)。用這種方法可以對完整細胞裂解物或組織提取物進行分析，也可以對亞細胞結構、提純的細胞器或其它亞蛋白質組樣品進行檢測。
如果給待測樣品帶上穩定的同位素標記，我們就可以對樣品中不同蛋白質的豐度進行檢測了，這些蛋白質可能在化學性質方面是一樣的，但是我們可以通過不同的同位素信號強度比對它們進行區分(圖3A)。也可以使用如圖3B中所示的串聯標記(tandem mass tag)方法對樣品進行多次質譜分析。還可以在進行質譜分析之前往待測樣品中添加定量的同位素標記肽段，以獲得樣品準確的定量數據(圖3C)。
這種“鳥槍法”最大的優勢就是簡單，不論從理論層面來說還是從實驗操作層面來說都很簡單，該方法相比前面所述的各種方法能夠對蛋白質組分進行更大程度的覆蓋，同時定量的準確性更高。不過該方法也有其局限性，具體表現在動態范圍不夠，難以使用生物信息學方法從大量的、高冗余的、復雜的蛋白質組樣品質譜數據中推斷出蛋白質序列。幸好這些問題已經部分得到了解決，通過裂解的方法可以降低樣品的復雜程度。常用的裂解方法主要針對的都是蛋白質組中生物信息學資料豐富的部分，比如富含半胱氨酸的肽段、磷酸化的肽段、糖基化的肽段等等。這種“鳥槍法”策略最適合用于快速鑒定復雜樣品中的組分，也非常適合用于對不同樣品中同一蛋白質的定量比較研究。在“鳥槍法”策略中，在蛋白質水解過程里，不同肽段間的聯系信息以及肽段與其來源蛋白質間的聯系信息都已經丟失了，因此該方法不太適合用于對具有多重修飾的蛋白質進行鑒定工作。