質譜沙龍第二十一期活動報道

【導語】在藥物分析的技術討論之外，拓展了質譜沙龍的涉及范圍：增加了質譜相關新技術MassWorks的討論；GC/MS在公安法醫中的應用；以及蛋白質組學同位素標記、磷酸化翻譯后修飾鑒定的最新研究進展。

　　2009年7月25日下午，質譜沙龍第二十一期活動在第二炮兵總醫院胃食管返流中心示教室舉行。除了來自發酵研究院、二炮總醫院、清華大學、AB公司的老朋友外，還有來自中科院研究生院、中科院高能物理研究所、公安部物證鑒定中心、和北京綠綿科技公司的新朋友。

　　

第二十一期質譜沙龍活動現場

　　第二炮兵總醫院質譜檢測中心簡介及定量應用

　　

第二炮兵總醫院藥劑科 李鵬飛老師

　　首先由來自第二炮兵總醫院藥劑科的李鵬飛老師向大家介紹了二炮總醫院藥學部質檢中心科研方向與發展工作簡介。

　　二炮總醫院質譜檢測平臺主要工作方向包括中毒藥物快速篩查、體內藥物分析測試及I期新藥試驗測試。該平臺于2006年3月安裝3200 Qtrap型液相色譜質譜儀，還配備氮吹儀、固相萃取儀、高精度天平、高速離心機等。

　　該質譜檢測平臺的研究方向首先是為臨床服務，例如利用質譜技術進行血藥濃度監測、建立定量檢測人體內44種氨基酸的準確方法、中毒藥物多目標快速篩查與定量等等;第二方面是科研創新，與北師大一起進行一些課題研究如參與863課題——結直腸癌脂類組學腫瘤早期診斷新技術的研發、973課題海河項目——環境中8種雌激素的檢測工作;第三方面則是成果轉化，注重研究成果的應用性。

　　接下來李鵬飛老師重點講述了質譜技術在醫院藥學方面的定量應用要點。

　　靈敏度問題：

1. 要用目標離子的碎片定量，特征性強，排除干擾。可考慮分子離子峰、準分子離子峰或特征碎片。
2. 在定量分析的方法設置上，盡可能提高掃描速率。提高準確率和重復性，可以通過減小掃描質量數的范圍來提高目標峰的掃描次數，或將一個樣品全部分析時間段分成多個segments，對目標離子單獨設置掃描模式。
3. 一定要通過色譜柱分離后定量分析。避免競爭性離子的存在影響目標離子的離子化效率;如果目標分子未與競爭性分子完全分開，則在離子化過程中導致目標分子的離子化效率降低，導致樣品分子的定量結果偏低，當然標準濃度的樣品也要用相同的方法分析。
4. 如果樣品都是純品的話可以不經過色譜柱直接進樣分析。

 

　　關于重現性的經驗和小技巧：

1. 如果用的離子源的噴針位置是可移的話，一定要記住做標準曲線時的位置，否則其位置移動后在相同的條件下進入質譜的離子流量會發生改變，標準曲線就不能使用了。
2. 所建立的標準曲線一個月后如果想重復使用，則用QC樣品檢驗一下該標準曲線!
3. 對于已經建立好的分析方法在掃描范圍、流動相的組成、梯度或流速等方面不要作任何改動，否則，標準曲線要重作。
4. 對于熱穩定性不好的樣品可以通過提高氣速，降低毛細管溫度的方法保證定量分析的重復性；一旦方法固定后不要輕易改動。

 

　　多組分同時定量的方法中出現的一些問題和對策

       1、各組分定量限相差極大，檢測限上的限制。如：A濃度遠大于B藥(100~1000倍)。此時B藥檢出時，A藥高于質譜檢測上線;若A藥檢出時，B藥未檢出。

　　處理方法是：修改靈敏度高藥物的參數，使其響應值降低未到達質譜檢測上限。但該方法有一定的局限性，如果設置參數過低的話將會導致曲線不理想。在多離子通道時也可選用非最優離子對的方法或采用正負離子切換來解決靈敏度問題。

       2、曲線上的同步問題，A藥和B藥混合曲線不成線性。

　　國家藥代指導原則指出在該化合物線性研究不理想的情況下，可采用非線性曲線，但工作曲線上的點一定要充足。

　　3、單組分質控不各格，而其余組分合格問題。

　　指導原則是對于不同濃度組分只允許兩個不合格出現，所以根據具體情況酌情處理。

 

　　本網收錄前沿Lab：第二炮兵總醫院分析中心

　　報告下載：《第二炮兵總醫院質譜檢測中心簡介及定量應用》

 

　　質譜校正和化合物鑒定的新技術——MassWorks及其應用

　　

北京綠綿科技有限公司 李衛健 老師

　　來自北京綠綿科技有限公司的李衛健老師為大家帶來了《質譜校正和化合物鑒定的新技術——MassWorks及其應用》的報告。

　　MassWorks是一個第三方的質譜軟件，即支持AB、Agilent、Thermo、Waters、Varian等公司質譜的數據，可在低分辨的質譜上實現精確質量測定，幫助預測分子式;并在Q-TOF等高分辨質譜上提高分子式預測的準確度。

　　那么它究竟是什么原理呢?為什么TOF的分辨率比四極桿一般只高了5倍，而質量準確度卻比四極桿高了幾百倍?

　　李老師首先從經典公式和問題著手，將Cerno公司的這項技術娓娓道來。

　　目前單級四極桿質譜無法獲得精確質量數的原因有如下兩點：

1. 四極桿質譜圖的峰形不能達到理想的正態分布，從而很難判斷真正質心的位置；
2. 質量軸存在漂移，所以不能得到精確的質量數。

      而MassWorks軟件一方面通過對峰形的校正得到正態分布的峰形，再一方面通過一些標準物質來校正質量軸，從而實現在低分辨質譜上測量精確質量數。

　　接下來李老師詳細介紹了MassWorks軟件的工作流程。

1. 用已知精確分子量的標準物質(和待測物的質量接近會更好)，采集Profile輪廓質譜圖；
2. 輸入已知分子量，MassWorks會自動調用儀器采集的質譜圖通過計算得到校正函數；
3. 測定真實樣品，采集其Profile輪廓質譜圖；
4. 用校正函數對實際樣品的質譜圖校正，峰形得到校正，并獲得精確的質心位置，從而得到精確質量數。
5. 軟件自動預測候選分子式。在預測方面，由于構成化合物的每一個元素在自然界中的精確質量數是固定的，同位素分布在一定時期內也是固定的，因此每一個分子式都存在一個固定的精確質量數和固定的同位素分布的比例，MassWorks計算和預測時還考慮了同位素分布的影響因素，因此，將不僅對低分辨質譜，同樣對高分辨質譜，只要能獲得較好的同位素峰形，加上精確質量數，也會大大提高預測分子式的準確度。

　　李老師通過介紹一個真實的應用檢測例子——MassWorks結合LC/MS準確測定奎諾酮類藥物分子式，得出的實驗結論是：

• 借助Massworks可以在低分辨率質譜上測定奎諾酮類藥物的精確質量數，質量誤差小于10mDa；
• MassWorks的譜圖準確度功能(考慮同位素分布)幫助我們實現在低分辨率質譜上奎諾酮類藥物分子式的準確識別，位于待選目標物的第1位；
• MassWorks操作簡便快速;可隨時對質譜采集的數據進行精確質量數的確定；
• 線性范圍寬：100萬～5000萬信號強度；
• 無需頻繁地校正儀器。

　　只要被測物質之間存在一定的理化性質差別，借助色譜可以將其分開或被測物質的質量誤差相差在2Da以上、及質量數不一樣的前提下，便可實現低分辨質譜+MassWorks = 具有高分辨質譜的功能。

　　MassWorks軟件的應用領域十分廣泛，包括有機合成產物或付產物的鑒定、降解產物的鑒定、農殘的鑒定、代謝產物的鑒定、天然產品中有效化合物的鑒定等等。

　　現有用戶包括國家煙草研究所AB質譜儀的用戶;陜西、廣東、寧波出入境檢驗檢疫局、北京林業大學;上海白鷺制藥等等。

　　結論：

1. 高分辨質譜可得到化合物精確質量數通過適當的校正，低分辨質譜也能實現精確質量數測定，并得到分子式；
2. 對于質量誤差可達到100ppb的高分辨質譜儀在識別分子式時也不能得到唯一的分子式，結合MassWorks的譜圖準確度功能(考慮同位素分布)可以幫助確認唯一分子式；
3. MassWorks讓普通質譜實驗室也可以實現精確質量數測定，并對分子式確認，擴展了現有儀器的使用功能；
4. 成本低，使用快捷、方便；
5. 由于該軟件是一個第三方軟件，所以廣泛適用于AB、Agilent、ThermoFisher、Waters、Bruker、Varian公司的四級桿質譜，進行精確質量數的確定和分子式的識別，也可用于其高分辨質譜上幫助確認唯一分子式。

　　本網站關于MassWorks軟件的博客：MassWorks分子識別

　　報告下載：《質譜校正和化合物鑒定的新技術——MassWorks及其應用》

 

　　GC-MS在助燃劑、爆炸物等高分子化合物的應用

　　

公安部第二研究所儀器分析室 徐建中老師

　　來自公安部第二研究所儀器分析室的徐建中老師給大家帶來了關于《GC-MS在助燃劑、爆炸物等高分子化合物的應用》報告。

　　質譜技術在爆炸案、縱火案中，可以通過鑒定殘留物來幫助推斷事故原因，給消防或刑偵提供科學依據。

　　在檢測未知化合物時一般的分析方法是：首先利用紅外或掃描電鏡來確定該物質是無機化合物還是有機化合物，如是有機化合物則做質譜分析，如在譜圖庫里檢索不到該物質(概率為20%左右)，接下來就要對該物質進行分離，一般采用薄層板使未知物分離出來，采用化學源或液質聯用技術確定分子離子峰，通過紅外、紫外、高分辨質譜綜合確定該化合物的結構。

　　在縱火案件中主要檢測的助燃劑一般為輕質礦物油(汽油、煤油、柴油)。檢測提取的方法很多如：

• 蒸餾法提取
• 溶劑提取
• 靜態頂空提取
• 吸附解析提取
• 固相微萃取法

　　溶劑提取法如用正己烷、乙醚作溶劑時，但實際從現場獲得的樣品很復雜量又很少，如濃縮到100倍的話，濃縮后的物質很多都是苯系物、芳香烴類的物質和縱火劑完全相同，所以徐老師指出一般不采用這種方法，除非對所有樣品進行蒸餾，去除干擾成分。

　　吸附解析提取法也存有一定的問題，如大氣中的汽油同時含有很多苯系物、芳香烴，在進行動態吸附時會干擾檢測結果。

　　最常采用的方法為固相微萃取技術，該方法在密封的條件進行加熱吸附后直接進入色質檢測，提取效率高，主要吸附輕質化合物如芳香烴、苯、二甲苯、三甲苯等等，該方法只能吸附到C15、C16，所以一般使用該方法檢測汽油。

　　接下來徐老師為大家詳細介紹了一個縱火案的現場，舉例說明，如用固相微萃取法進行提取時，由于該方法只能吸附到C15、C16高碳數無法吸附，所以還要對化合物進行溶劑提取查看是否含有高碳量的物質，最終確定導火索是助燃劑還是現場其它物質。徐老師強調指出檢測時一定要把被分析物質研究清楚，這樣得出的結論才能正確。

　　在爆炸案中主要檢測方向是確定炸藥性質、炸藥的來源、起爆方式等，為偵查破案提供依據。樣品提取方法有：

• 溶劑提取
• 固相微萃取法
• 固相微萃取膜技術
• 超臨界流體技術
• 加速溶劑提取技術

　　實際檢測中一般常使用丙酮作為溶劑進行提取，在檢測中炸藥TNT一般使用30m的柱子，由于硝化甘油和一些黑索今易分解所以采用8m的短柱子分離，在質譜上分析炸藥時一般采用負化學源，靈敏度相對較高。

 

　　Neurospora生物鐘調控蛋白WC1、FRQ定量磷酸化分析

　　

北京生命科學研究所蛋白質中心 龍承祖老師

　　最后由來自北京生命科學研究所蛋白質中心的龍承祖老師為大家帶了關于《Neurospora生物鐘調控蛋白WC1、FRQ定量磷酸化分析》的報告，該課題是德克薩斯大學西南醫學中心 Dr. Yi Liu 實驗室與北京生命科學研究所蛋白質中心共同合作研究。

　　本實驗主要應用¹⁵N進行標記，由于蛋白質的組成元素主要是C、H、O、S、N，在培養植物或微生物的時候，把15N的鹽作為其唯一的N源，經過標記若干代之后，其原來體內的¹⁴N就全部被代謝為¹⁵N，這樣該植物或微生物在質譜上就可區別于其它樣品。

　　生物鐘是生物體內一個24小時左右的生化，生理以及行為方面的節律。生物鐘在動物，植物和微生物中廣泛存在，對維持正常的生理周期起到重要作用。Neurospora中文名叫糙脈孢菌，是生長在面包上的一種紅霉，該菌在每天中午的時候會釋放孢子變成紅色。該真菌調控生物鐘的蛋白WC1、FRQ在人和哺乳動物里是相對保守的體系，所以有對其研究的必要性，也是研究生物鐘的重要工具。

　　WC1是一個轉錄因子，結合在DNA上游區域，從而控制FRQ的轉錄，WC1被磷酸化之后蛋白質上會發生翻譯后的修飾，當其受到外界刺激(如光或病原物)的時候被迅速修飾，具備了原先沒有的功能。WC1被磷酸化之后結合到DNA的上游區域，轉錄成另外一個FRQ蛋白，該蛋白會把WC1降解掉。該報告主要研究的就是FRQ、WC1是如何實現生物鐘的調控節律。

　　使用液質聯用技術來研究FRQ磷酸化了WC1上的哪些位點，FRQ對這些位點啟到那些作用。建立的實驗方法是把一個Neurospora中的FRQ進行突變，則該真菌里就不存在FRQ蛋白，選用一種野生型的真菌用¹⁵N進行培養并標記，把FRQ的突變體用¹⁴N培養并標記，如果磷酸化不是受FRQ影響的話¹⁴N與¹⁵N的比例應是1:1的關系，如果是由FRQ引起的磷酸化從譜圖上應該呈現¹⁵N的峰比¹⁴N的峰高。

　　最終鑒定得到了Neurospora生物鐘重要調控蛋白FRQ的體內43個新磷酸化位點，其中33個為可能的體外磷酸化位點，得出S990和S995這兩個位點的磷酸化不依賴于FRQ，是由PKA作為起始激酶磷酸化而得到的。

　　報告下載：《Neurospora生物鐘調控蛋白WC1、FRQ定量磷酸化分析》

 

　　報告結束后，會議室里還一直洋溢著熱烈的討論氛圍。大家對MassWorks和GC/MS技術如何應用于藥物分析、代謝物鑒定; 蛋白質組學的同位素標記技術如何應用于其它方面的研究，都很感興趣，也和專家們展開了持續的探討。

　　

報告后討論現場