質譜鑒定常見問題解答

　　 1. 一級質譜和二級質譜有什么區別？什么時候做一級，什么時候做二級？

　　答：一級質譜鑒定的方式主要指胎指紋圖譜（PMF），即利用質譜儀精確測量酶解片段的分子量并搜庫比較實現蛋白質的鑒定，二級質譜是在一級質譜的基礎上再選擇部分肽段做進一步的破碎并對碎片進行深入分析和比較，鑒定出該肽段的序列并結合PMF的結果從而實現蛋白質的鑒定。二級質譜能夠得到部分肽短的序列，具有更高的可靠性。隨著現在雜志對數據的要求越來越嚴格，二級質譜鑒定是蛋白鑒定的大趨勢，而且即使目前做一級質譜鑒定的結果，也需要挑選部分PMF結果做二級質譜驗證。

　　2. 研究的物種不是模式生物怎么辦？

　　答：可以參考親緣關系最近的模式生物做比對而實現蛋白質的成功鑒定，如果質譜圖很好而沒有鑒定結果說明這是一個全新的蛋白，可以采用de-novo等技術做深入分析與鑒定。

　　3. 該如何評價質譜效果的好壞？

　　答：做PMF一般得分超過60分（P<0.05）就算成功鑒定，而串聯質譜，得分超過60分或者雖然沒有超過60分，但是有最少一條肽段的得分超過30分就算成功鑒定。

　　4. 一些特殊的質譜方法有什么用途？

　　答：質譜的其它用途包括磷酸化位點分析、蛋白測序、混合蛋白鑒定（shotgun技術）以及分子量精確測定、二硫鍵位置分析等等。

　　5. 用什么染色方法比較好？

　　答：最好用考馬斯亮藍法進行染色，銀染也可以，但鑒定成功率稍低，并且推薦用串聯質譜對銀染蛋白進行鑒定可以大大提高鑒定成功率。

　　6. 凝膠是否可以長期保存？該如何保持？對鑒定效果有影響嗎？

　　答：如果保存時間超過一個月，可以用保鮮膜包裹后放入冰箱保持，如果小于一個月，則可以常溫保持，不會影響質譜鑒定效果。

　　7. 質譜鑒定取膠點該如何取？有什么注意事項？

　　答：取點的時候將0.2ml的槍頭前端剪去一點，用槍頭將凝膠戳取下來并轉移至0.5ml離心管中，用水將膠粒反復吸打沖洗兩至三次，最后吸干離心管中所有水分封蓋保存。離心管最好用進口離心管，以免塑料污染；水最好用去離子水或者雙蒸水；取點的時候帶好口罩與手套，以免角蛋白污染。