賽默飛世爾科技：為蛋白質組學提供深層次解決方案

　　【導語】 毫不夸張地說，蛋白質組學的興起推動了整個質譜的研發和應用，使質譜產品層出不窮，并應用于更多的組學、更多的復雜體系研究中。蛋白質組學面臨的挑戰也促使質譜的研發者們不斷推出創新的技術，比如第6種質量分析器Orbitrap的出現，以及隨之出現的一系列新的研究流程和方法。在第六屆AOHUPO會議期間，本網記者有幸采訪到賽默飛世爾科技蛋白質組學市場總監 Andreas FR Huhmer博士，賽默飛世爾科技蛋白質組學軟件戰略營銷經理 David Horn博士和賽默飛世爾科技色譜質譜中國區市場經理王勇為先生，他們將為我們詳細介紹在蛋白質組學研究領域，Thermo Fisher Scientific從生物樣品前處理產品、到色譜產品質譜產品、以及蛋白質組學數據處理軟件產品等整個分析流程中擁有的創新產品技術及其應用，希望對您正在進行的方向有幫助……

賽默飛世爾科技蛋白質組學軟件戰略營銷經理 David Horn博士（左），賽默飛世爾科技蛋白質組學市場總監 Andreas FR Huhmer博士（右）

蛋白質組學領域面臨的挑戰

　　2001年國際人類蛋白質組組織的成立，極大地推動了蛋白質組研究的發展。10年來，國際蛋白質組學無論從技術方法和研究策略，還是研究資源和研究領域等都有了質的飛躍。國際上主要發達國家和地區紛紛加大對蛋白質組學的支持力度，這一研究領域也由此成為各強國科技角力的新戰場。本次AOHUPO大會上，秦鈞教授介紹了2010年開始立項的中國“鳳凰工程”計劃，將使中國站在蛋白質組學研究新的國際制高點上。連Huhmer博士也不禁贊嘆：中國對于蛋白質組學的投資和決心是世界上非常突出的。

　　近年來在蛋白質組定量分析，翻譯后修飾研究、規模化相互作用及功能研究、 生物標志物的篩選驗證、抗體制備、數據標準和數據挖掘等方向，科學家們取得了一系列突破性進展。蛋白質組學技術已成為幾乎所有國際著名醫學研究機構的重要支撐平臺，在疾病研究中的應用更加廣泛。國際上也先后啟動了多種疾病的蛋白質組研究計劃，目標是直接尋找疾病相關特異蛋白質或對疾病相關已知蛋白質進行深入機制分析。

　　當談及蛋白質組學目前面臨的主要技術挑戰時，Andreas FR Huhmer博士告訴我們，當前蛋白質組學領域最大的討論熱點還是蛋白質組樣品的復雜性，如何使方法具有足夠的靈敏度、檢測到所有蛋白的信息，找出有意義的生物標志物，定性、定量并解釋它們，是當今面臨的最大挑戰。例如各種癌癥的蛋白質組是非常復雜的，生物學家們還沒有辦法搞清楚里面有多少相關的組分，也不能給予充分的生物學解釋，因此，目前還不能攻克。

創新技術及完整操作流程解決方案

　　在蛋白質組學如此復雜的研究中，當談及賽默飛世爾科技如何能夠保持其競爭優勢時，Huhmer博士言簡意賅地回答到：“創新（Innovation）！”

　　接下來他談到，質譜技術由于具有極高的靈敏度、對于復雜物質體系強大的解析能力，成為蛋白質組研究的核心工具，也是目前蛋白質組研究技術中最具活力和潛力的技術。賽默飛最大的競爭優勢正是在于質譜技術的不斷創新，比如推出世界上獨一無二的Orbitrap質譜。同時不僅限于質譜，賽默飛還提供非常創新的化學試劑（如TMT、SILAC）、高效的分離產品、以及數據處理軟件產品等。擁有了這些獨立的創新產品后，賽默飛提供了從前端處理、分離，到儀器、到軟件的完整工作流程解決方案，這是其它的競爭者所無法做到的。通過這些創新產品和完整的工作流程，賽默飛能幫助科學家們大幅提高研究工作的效率，更有信心地面對蛋白質組學的挑戰。

蛋白分析整體操作流程解決方案

　　采訪中，Andreas FR Huhmer博士與David Horn博士為我們詳細介紹了整個操作流程中的相關創新技術及其應用。

　　Orbitrap技術，使賽默飛再次成為質譜全球領導者

　　數十年來，質譜界的質量分析器只有5種：四極桿、離子阱、飛行時間、磁質譜、FT ICR，而Orbitrap的出現，給了全球一個驚喜——這是第6種質量分析器。在AOHUPO會議期間的workshop中，Huhmer博士向大家回顧了Thermo Scientific Orbitrap質譜技術的發展歷程。1999年提出了Orbitrap質量分析器的概念；2000年實現了Orbitrap質譜分辨率>100,000；2005年推出了首臺商品化的LTQ Orbitrap質譜；2008年推出建立在Orbitrap技術基礎上的Exactive臺式LC-MS系統；2009年推出了LTQ Orbitrap Velos軌道阱質譜儀；2011年ASMS上，推出了分辨率達14萬的新型Q Exactive復合式高性能臺式四極桿-軌道阱質譜儀，和分辨率高達24萬的Orbitrap Elite高場軌道阱組合質譜儀。

　　在整個蛋白質組學研究過程中，賽默飛在各個階段都提供了質譜解決方案，并進一步使其成為更容易獲得和操控的臺式儀器。在發現（Discovery）階段，可使用Orbitrap進行蛋白質鑒定和相對定量；在目標物驗證（Target Verification）階段，可使用Q Exactive進行絕對或相對的定量；在目標物定量（Target Quantitation）階段，可使用TSQ Vantage三重四極桿質譜進行絕對的定量。

　　談到Orbitrap質譜的創新，Huhmer博士深情地表達：“People love Orbitrap”（人們熱愛Orbitrap）。Orbitrap技術之所以如此流行，原因就是，這是一種超高分辨、超高性能的儀器，以前操控這種技術需要質譜的專家，令有很多天才想法的生物科學家們望而卻步。而Orbitrap使分析人員非常容易上手和操控，并獲得極其“漂亮”的結果。以前，只有質譜領域的專家才能夠做幾十萬分辨率的試驗，Orbitrap技術出現后，現在任何水平的分析人員都可以去做幾十萬分辨率的質譜分析，這是個很大的改變。

　　Huhmer博士還分享了一個實例：“哈佛大學生物系的研究者們有很多創新的想法，但要獲得好的數據，以前都要將樣品送到外面去檢測。現在他們自己買了Orbitrap儀器，自己可以開始分析這些樣品，并獲得同樣甚至更好的結果。其中很重要的一個原因就是，Orbitrap能夠被很多人掌握、使用。這些專門搞生物學研究的應用科學家們，也可以直接操作質譜，獲得完美結果。”

　　 筆者追問：“那對于能夠使用FTICR-MS的專家們，Orbitrap是不是就沒有競爭力了呢？”嚴謹的Huhmer博士回答道：“FTICR-MS確實能夠做一些特別的事情，最主要還是依靠它更高的分辨率。但FT-MS對于純品或不太復雜的樣品也許更有用；對于LC-MS，卻由于采集速度等問題無法很好實現聯用，即針對如蛋白質組學這樣復雜的樣品，無法發揮其更高分辨率的效果。同時FTICR-MS不僅操作復雜，維護也不是很方便。Thermo Scientific在2003年曾推出過FTICR-MS，但2005年推出Orbitrap后，我們自己放棄了FTICR-MS的生產線，因為FTICR-MS不能被更多人使用。” David Horn博士補充說：“我以前就是FTICR-MS的使用者，由于維護需要液氮液氦，根本無法斷電，對于維護人員的神經是一個挑戰。而Orbitrap對于我這樣的FTICR-MS使用者來說，可以大大減輕我們的工作，因為它是即開即用的！不久前，我比較過Orbitrap Elite（分辨率高達24萬）和FTICR-MS獲得的數據，Orbitrap Elite的數據毫不遜色、而且更好。因此，即使對于能夠操控FTICR-MS的專家們來說，使用Orbitrap，也能讓他們更快、更方便地獲得高質量的數據。”

　　定量蛋白試劑盒

　　在蛋白分析相關的試劑消耗品方面，Thermo Fisher Scientific都是直接在儀器上開發的。由于試劑和儀器時配套的，從而能夠提高分析效率。例如細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術（SILAC）和串聯質譜標簽（tandem mass tag）試劑盒。

　　細胞培養氨基酸穩定同位素標記技術（SILAC）

SILAC的基本原理

　　SILAC技術的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(重型)標記的必需氨基酸取代細胞培養基中相應氨基酸，細胞經5-6個倍增周期后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數或蛋白量等比例混合，經分離、純化后進行質譜鑒定。

　　SILAC法彌補了質譜在定量方面的局限，與分析和生化處理過程具有很好的兼容性，SILAC法標記效率高、損失小；標記誤差低，可靠性高。

　　串聯質譜標簽（tandem mass tag）TMT試劑盒

TMT試劑盒

　　賽默飛世爾科技推出的串聯質譜標簽（tandem mass tag）試劑盒，被稱為TMT，用于標記實驗。TMT包含帶有氨基活性基團的等量的串聯質量標簽，一個質量歸一化的連接子，一個可斷裂的化學鍵，和報告離子 （reporter ion）系列。使用這些試劑，研究者們能夠在一個樣本中專門標記肽和蛋白，然后進行相對或絕對的定量。該方法能夠分析一個樣品中的每一個單獨的蛋白，可同時最多分析6個樣品。

　　蛋白質組學軟件：擊中目標

　　Proteome Discoverer軟件

　　據David Horn先生博士介紹，蛋白質組學數據處理是非常復雜的，這里面有幾個階段：第一步就是把質譜原始數據轉換為蛋白的鑒定結果。Thermo Scientific擁有的軟件平臺——Proteome Discoverer軟件，這個軟件有很多特點，其中一個最大的特點就是可以自己設置數據處理的流程或模式，有了這種功能，可以最大限度地發揮軟件的功能。

　　Proteome Discoverer軟件的推出和很多實驗室進行合作，將他們的要求增加進去，該軟件的很多功能來自客戶的發明和創造，最新版本的Proteome Discoverer也獲得了來自中國實驗室的技術。

　　Proteome Discoverer既可以做定性，也可以做定量（包括同位素標記的定量和Label-Free的定量）。另外，一個主要的優點是可使用多個數據庫搜索引擎，從多種裂解方法中分析信息，從而發現更多的翻譯后修飾（PTMs），并提高多肽和蛋白鑒定的準確度。比如，在單次操作中，能同時分析CID（碰撞誘導解離）、ETD（電子轉移解離）、HCD（高能C阱裂解）的數據，提供結果的序列、翻譯后修飾和交叉確認信息。并且，從賽默飛世爾科技專有的、Z-Core算法（該算法分析由ETD產生的C-離子和Z-離子譜圖）中獲得的信息，能和CID譜圖數據合并檢索，在一個簡單易讀的格式中提高蛋白的覆蓋率（protein coverage）。

　　ProteinCenter軟件

　　 當我們得到了一個蛋白質鑒定的結果和定量的數據，這并沒有完成整個數據處理。最終還是要將這些結果轉化為生物學的應用。因此，如何對獲得結果進行生物學意義的解釋說明，Thermo Scientific ProteinCenter軟件的推出則解決了上述問題。

　　ProteinCenter軟件可以從一個非常大的蛋白數據庫里獲取數據，將質譜鑒定的結果解釋為生物學上有意義的數據。該軟件的特點是速度非常快，幾分鐘就能將鑒定的蛋白質在生物學上的意義進行闡釋，將分析人員從先前大量的手工操作中解放出來。通過ProteinCenter軟件，能得知蛋白的重要性，屬于哪種類型，及其作用等等。

　　ProSightPC軟件

　　另外一個在蛋白質組學處理部分較為重要的軟件則是ProSightPC，該軟件是Thermo比較有特色的產品，是與美國西北大學化學生物學家Neil Kelleher教授共同合作開發的。該軟件主要針對自上而下（top-down）的蛋白質鑒定和表征而設計的，該軟件無需酶切方法便可進行分析，從而得到蛋白異構體和更為完整的序列信息。

　　除此之外，賽默飛還提供PinPoint軟件，可利用來自Orbitrap、Q-Exactive的高分辨準確質量的數據，加速開發定量實驗的流程。SEIVE軟件可快速幫助解析來自于差異表達蛋白質和多肽的數據。SimGlycan軟件，可識別和表征更多蛋白質、肽和翻譯后修飾（PTMs）。

　　 當問到這些軟件在操作上，對實驗室的計算能力有何要求時，Andreas FR Huhmer博士講到，軟件在設計方面有了很大的改進，新算法的不斷推出，分析速度大幅度提高，對計算機的要求反而降低。Thermo Fisher Scientific的相關軟件產品都裝在PC里一同提供給用戶，因此用戶不用擔心如何安裝等問題。且數據庫現在都建立在本地電腦上，高分辨數據對計算機的搜索速度要求是逐漸降低的，由于搜索窗口縮小，所以對計算的要求會更少，PC計算機就已足夠。

　　定量低豐度蛋白生物標志物的增強型解決方案

　　轉化醫學領域目前遇到的瓶頸即為如何對大量的生物標志物進行驗證，從分析的角度上看，如何檢測到這些低豐度的蛋白，并且能夠實現很好的重復性，是目前分析的一大挑戰。賽默飛世爾科技提供的KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統和MSIA技術（質譜免疫）都屬于免疫親和的純化技術，和對生物樣品中低豐度的蛋白質濃縮，是檢測低豐度蛋白的必備工具。

　　MSIA技術（質譜免疫）

　　2011年，Thermo Fisher Scientific收購了蛋白質組學樣品制備公司Intrinsic Bioprobes（http://www.antpedia.com/news/82/n-164882.html），該公司提供的ZL質譜免疫（MSIA，Mass Spectrometric Immunoassay）技術，通過通用的MSIA tips，可靈活定制由低到高不同通量的免疫分析，簡化免疫富集的同時，提高回收率和重現性。據Huhmer博士介紹，MSIA技術就是在tip里裝有樹脂，通過專有設備在樹脂上結合不同的抗體，能方便地對血漿樣品進行目標蛋白的純化和富集。

MSIA技術（質譜免疫）

　　MSIA技術能對生物樣品中低豐度蛋白進行濃縮，可快速穩定地分析血漿樣品中的生物標志物，得到高確信度的數據結果。比如通過MSIA技術，能夠在Q-Exactive質譜系統上快速進行血漿中生物標志物的驗證分析，并且獲得很好的重復性，檢測水平能夠達到pg/L。

　　KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統

KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統

　　KingFisher Flex全自動磁珠提取純化系統采用轉移磁珠而非轉移溶液的獨特ZL原理，使得提取純化效率大大提高。 該系統非常靈活，能夠做到從20ul到5ml樣品的自動化提取純化。 對任何初始材料（從動植物樣本、血液、土壤），可以提取純化任何樣品（從RNA、DNA、蛋白質到細胞），并得到高質量的產物。

　　采訪最后，Andreas FR Huhmer博士再一次強調，Thermo Fisher Scientific在蛋白質組學領域的戰略，就是繼續保持創新，并將前處理產品、色譜產品、質譜產品、以及蛋白質組學數據處理軟件產品更好地整合在一起，為用戶提供從產品、服務、技術支持的功能強大的完整解決方案。

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