趙方慶團隊提出環形RNA轉錄本重建和定量新方法

　　在以往的研究中，環形RNA的識別方法主要是利用環形RNA特有結構——反向剪接序列特征進行識別。然而，由于二代測序的讀長普遍較短，研究者們雖然可以獲得大量的反向剪接位點，卻無法高通量獲得環形RNA的完整內部結構信息，也無法對不同可變剪接產物進行精確定量。

　　2018年1月19日，Genome Medicine 在線發表了中國科學院北京生命科學研究院計算基因組學實驗室趙方慶團隊題為Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification的最新研究成果。該研究提出全新的環形轉錄本重構與定量的方法 (CIRI-full)，通過環形轉錄本測序中的反向重疊區特征獲得全長序列，既有效解決了環形轉錄本內部結構的重構難題，也為環形轉錄本中不同剪切產物的定量提供了新思路。

　　為了解決圍繞環狀RNA識別的問題，趙方慶團隊首先提出一個新的環形RNA識別特征：反向重疊區(Reverse overlap)（圖1）。該特征通常出現在讀長較長的環形RNA測序中。與以往的所有識別算法不同，該特征不僅可以用于判斷轉錄本雙端測序中的一對測序序列是否來自于環形RNA, 也可以用于判斷該序列是否可以覆蓋整個環形RNA。 研究人員利用該方法從不同哺乳動物的腦組織中獲得超過80%的環形RNA的全長序列。

圖1. 環形RNA全長轉錄本的重建方法

　　環形RNA的全長重建是對其精確定量的基礎。對于擁有多種可變剪接產物的環形RNA，CIRI-full采用蒙特卡羅法模擬來自不同剪切產物的讀段在全長序列上的分布，通過梯度下降法，篩選出與最優表達量組合。其中，每個外顯子上的測序覆蓋度及可變剪接事件都可用于判斷預測結果與真實情況的差異。 研究人員使用模擬和真實數據驗證了這種方法的準確性。對于每個BSJ位點產生多個可變剪接產物的表達數據，CIRI-full不僅可以靈敏地重構其全長序列，并且可以精確地預測其相對豐度（圖2）。

圖2. 環形RNA轉錄本水平的精準定量

　　CIRI-full 可以為環形RNA的研究提供更加全面的視角。以下有兩個環形RNA的研究案例。首先是多個物種中的環形RNA保守性分析。由于CIRI-full的全長重構功能，研究人員發現了跨物種間保守的環形RNA，它們相較于物種特異表達的環形RNA具有更高的表達量，更高的成環比和高保守的剪接模式，提示它們可能具有重要的功能。

　　另外一個應用是對環形RNA進行剪接產物水平的差異表達分析。研究人員比較了來自20個人的肝癌組織樣本與癌旁組織樣本中環形RNA的表達，發現擁有多個剪接產物的環形RNA中，不同的環形RNA剪接產物表達量的變化不完全一致。例如，某些環形RNA在癌旁組織中的表達量顯著高于腫瘤組織，但是其中某些可變剪接產物的表達量并未發生顯著變化。另外，研究人員還發現一類環形RNA，它們在兩種組織中的表達量都沒有顯著差異，但是它們的主要剪接產物形式會發生轉換（isoform switch）。這些發現都進一步表明CIRI-full可以讓研究者們清晰解讀環形RNA在生物體內表達的更多細節。

　　目前絕大多數環形RNA的功能尚未明確，并且現有方法無法提供足夠充足序列特征信息，該方法可以幫助研究者更有效地篩選出具有潛在功能的環形可變剪接產物，對環形RNA的功能研究與轉錄本水平上的差異表達分析具有重要的意義。此外，該研究為環形RNA組成和功能研究提供了新視角，呈現了環形轉錄本更加細致的內部結構，并實現了轉錄本水平的精確定量，為后續篩選有潛在功能的環形RNA分子提供了重要方法學工具。

圖3. CIRI-full在肝癌環形RNA研究中的應用

　　趙方慶團隊在前期的工作中建立了環形RNA識別、轉錄本組裝、可變剪接檢測及定量等方法，相關研究發表在相關工作發表在Genome Biology (2015)、Nature Communications (2016)、Briefings in Bioinformatics(2017)和Trends in Genetics (2018)。這些研究豐富了我們對環形RNA的組成及結構的認識，為深入解析這一嶄新類型的非編碼RNA分子提供了重要工具。

　　據悉，該工作主要由趙方慶課題組的博士研究生鄭毅和助理研究員冀培豐完成。