超聲波破碎細胞的常見問題（一）

大腸桿菌表達外源蛋白，在超聲破碎的時候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后超聲的效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對其他的一些細菌同樣起作用，比如鏈霉菌。細菌沉淀直接加樣品1buffer，再加5ul的巰基乙醇，混勻，離心，煮沸10min，直接上樣，染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當補點醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來水即可)在微波爐煮10min 就可以。

在表達重組蛋白后超聲波破碎細胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一會就產生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs和tris緩沖液都是這樣，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細胞中。

1*會產生氣泡是因為你的探頭位置沒放好。探頭一定要接近底部，約1cm（我一般是距底部0.5mm）。功率根據儀器不同會有所不同，但你可以觀察液面，有波動但不要太劇烈就好。

2*破3S停10S，破個二三十次看看。

3*變幅桿位置擺放也要注意，聽聲音如果不對的話就要及時調整。另外可以從菌濃度方面考慮。 在破碎時試著加大體積,強度最好不要超過60%.

4*嘗試超8s停8s,對有些菌體蛋白來說，你的方法很難散熱，導致蛋白變性產生氣泡，最好停頓時間稍長一 些，這種情況多見于包涵體形式的蛋白。

鏈霉菌（放線菌）超聲破碎的，用的方法條件是什么？

前處理一般就是配置成一定濃度的菌懸液。

使用超聲破碎時采用的具體條件是：

(1)取細菌的24 h培養液于5 000 r／min 下離心5 min收集菌體．

(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌3次，再用該緩沖液將菌體配成1：3的菌懸液．置于40 mL大塑料試管內．

(3)將大塑料試管置于冰浴中，采用超聲波破碎(功率200 W，1／2”探頭，破碎30 s，間歇30 S)．

(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷凍離心30 min，收集細胞碎片和上清夜．

超聲破菌流程與 上述基本一致，就是洗滌菌體也可以用預冷的生理鹽水或pH8的Tris－HCl，洗滌一次就 可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大，功率可以到400－600w，超5s，停5s，冰浴，要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強度和次數，有必要隨時鏡檢觀察菌體是否完全破碎。

放線菌屬于原核生物系統進化樹上的（G＋C）摩爾百分含量（mol％）高的革蘭氏陽性菌 （Eubacteria）分枝類群，它雖然具有原核生物特有的分子生物學特性，但在其不同類群中，細胞壁的化學 組分變化很大。

在做大腸桿菌超聲時，采用的是400W，超5停5的方法，效果不錯，但是用在鏈霉菌上，似乎沒什么效果。會不會就是由于細胞壁組成差異造成的呢，因為大腸桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。

再有鏡檢是檢驗破碎效果,但是細胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關系嗎？破碎時間長也會影響到酶的活性。所以想問問anaisai戰友，你提供的“功率200 W，1／2”探頭，破碎30 s，間歇30 S”的條件好像是用于破碎鏈霉菌孢子的，也可以用于發酵離心后的菌泥嗎？如果可以，你破碎的全程時間大概是多少呢？

如果你需要的是胞內酶，細胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關系。破碎時間長的確會影響到酶的活性。這就需要在最佳的破碎時間和酶活性之間做出判斷，最直接的辦法是先繪制相關曲線（酶活性和時間的關系曲線）。

實驗中，破碎的是棒狀桿菌（也是很難破壁的G+菌），破碎時間控制在30min左右，酶活較好。

如果是基質菌絲的話,好可以考慮用溶菌酶處理一下.