超聲波破碎細胞的常見問題（二）

一般來講這幾種方法讀可以的:

一,液氮研磨

二,用french press破碎

三，超聲波破碎

四，溶菌酶處理預處理

超聲波是物質介質中的一種彈性機械波，它既是一種波動形式,又是一種能量形式。超聲對細胞的作用主要有熱效應，空化效應和機械效應。熱效應是當超聲在介質中傳播時，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動，使部分能量轉化為局部高熱（42－43℃）。空化效應是在超聲照射下，生物體內形成空泡，隨著空泡震動和 其猛烈的聚爆而產生出機械剪切壓力和動蕩。另外，空化泡破裂時產生瞬時高溫（約5000℃）、高壓（可達 500×104Pa），可使水蒸氣熱解離產生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應可導致多聚物降解、酶失活、脂質過氧化和細胞殺傷。機械效應是超聲的原發效應，超聲波在傳播過程中介質質點交替地壓縮與伸張構成了壓力變化，引起細胞結構損傷。損傷作用的強弱與超聲的頻率和強度密切相關。

100g大腸桿菌溶于1L破碎液里（破碎掖：50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl），攪 拌，發現菌液發粘，菌體不能夠很好分散，用高壓勻質機破碎，加壓后，菌液不能進入勻質機，速度很慢，

請問是何原因？能有好的辦法解決，很好用勻質機快速破碎菌體？

將破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大 。超聲處理5－10分鐘，菌液粘度即可大大降低，也可促進菌體分散。

不同型號的設備功率不一樣，功率的大小決定了使用變幅桿的大小范圍（直徑2mm至幾十毫米），你使用多大的變幅桿就在設備的上調至該刻度（很簡單的）！變幅桿的大小決定了處理量5ml一下選3mm，5～50ml可選6～8mm，50ml以上選10mm的變幅桿，依此類推！占空比不用關心的，主要是指超聲時間和停頓時間的比值。

酵母破碎的問題

一般的PROTOCOL都是用glass beads  破碎酵母細胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠，效率很高，而且對目的蛋白活性不會有什么影響。一般應該用這個方法。

化學裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分攪拌至液體狀。此法的裂解效果不錯的加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值

8.0），據說效果可以。

畢氏酵母細胞破碎法

在破碎遇到的問題是菌體濃度太低，OD620nm在4-6之間。細胞破碎儀的最低破碎體積為4ml左右，這樣再稀釋一倍，OD就到2-3啦，我們懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測定時會測不準。所以請教大家細胞破碎時最低的菌濃多少為下限？我們的菌是一種棒桿菌。 破碎后，你可將液體放入透析袋中濃縮。

我們所做的方法是按照1：20的比例將離心后的菌體（e.coli）溶解于超聲緩沖液（50mM 磷酸 pH 8.0 ）300w 10s/10s 破碎20分鐘。做了鏡檢！基本全被破碎了！我做蛋白純化的，做的包涵體。實驗中 我們的菌體濃度相對獨立，與培養液中的菌體od無關，不收其限制，便于操作者調控。

一般按每g濕菌體加5-10ml裂菌緩沖液。

超聲肯定會產熱，所以一定要有降溫裝置，除非你需要得成分耐高溫。