超多重PCR技術及其在臨床病原微生物檢測的應用（一）

圖1.PCR流程示意圖（來源：中國儀器網）

1.1.2 多重PCR技術

PCR產生以來，以常規 PCR 為基礎衍生出一系列新的 PCR 檢測技術。多重PCR(multiplex PCR, mPCR)顧名思義，是在一個反應體系中進行兩種及以上PCR片段特異性擴增的技術，由Chambehian于1988年提出，其反應原理、操作過程及儀器均與常規PCR相同，優勢在于可以對不同的模板實現一次性同時擴增，檢測通量有所提升，同時在引入定量內參的情況下，還可指征模板的數量情況。

對于PCR擴增產物進行結果分析的傳統方式有限制性內切酶消化鑒定、基于電泳的方法，包括瓊脂糖凝膠電泳、微流控毛細管電泳、聚丙酰胺凝膠電泳等。對PCR產物進行電泳，由于DNA片段整體帶負電荷，在電場作用下會在電泳儀內向正極遷移，遷移速率受PCR擴增片段大小的影響。故可將大小不同的PCR產物在電泳過程中分開。該方法快速且成本較低，但由于通過片段大小判斷PCR過程中是否發生特異性擴增，因此引物設計在考慮特異性的同時，不同擴增片段的長度差異需高于電泳的分辨率。因此這一檢測手段的分辨率從源頭上限制了多重PCR中可以最大同步擴增的產物數量。

伴隨著測序技術，尤其是NGS技術的發展，對PCR產物進行高靈敏度及高分辨率的檢測成為了可能，因此多重PCR可同步擴增的片段數量上限演變為多重PCR自身體系的限制。不同于傳統僅僅進行4-5重，至多30重的PCR反應體系，上千重甚至上萬重的超多重PCR(high-multiplex PCR或ultrahigh-multiplex PCR)的實現輔以NGS測序，形成的靶向-NGS（tNGS）技術已逐漸在遺傳病診斷、腫瘤基因檢測等領域發揮作用。

1.2 超多重PCR技術要點簡介

超多重PCR的難點在于，若想在一個體系中實現上百、上千甚至上萬個片段的特異性擴增，并非簡單將引物混合擴增即可。不同引物的特異性、不同擴增片段本身的特異性及擴增條件均為需要綜合考慮的內容。設計超多重PCR時，至少需要綜合考慮以下幾點因素：

1.  目的基因片段的選擇：需要擴增的目的基因片段需要具有足夠的特異性，否則容易在退火階段出現不同基因片段之間的非特異性配對，導至PCR效率降低。

2.  引物設計：特異性，即多對引物之間不能互補，尤其需要避免3’端互補；長度，引物需要具有一定的長度實現其特異性，但較長的引物會更容易引起引物二聚體形成，降低引物有效濃度；退火溫度，引物Tm值需要相對高一些以提高退火溫度，在后續mPCR中選用最低退火溫度以增加擴增特異性。

3.  反應體系：反應體系中各組分需滿足每隊引物對應靶點擴增量的需求。比如dNTP能夠結合Mg2+,但DNA聚合酶發揮活性有賴于游離的Mg2+，因此dNTP和Mg2+的濃度需要有所平衡;DNA聚合酶含量過低造成擴增產物的降低，含量過高容易導至不同濃度模板的不均勻擴增以及背景擴增升高等問題。

由此可見，超多重PCR希望實現較好的擴增性能，需要綜合考慮反應多方條件，具有極高的技術壁壘，目前全球真正掌握該技術的公司數量屈指可數。