本法是將樣品放在一個連續的密度梯度液體上，通過離心，大顆粒沉降快，小顆粒沉降慢。經過一段時間，相同的顆粒就在同一深度
形成一條帶子，因此把各種組份分開來。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質，如不同的蛋白質組份密度都差不多，但分子量不一樣，用本法很容易將其分開。但對密度不同、大小類似的物質則不易分離。
蔗糖梯度是一種常用的介質。用不同濃度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度，用于梯度離心。再分別進行收集處于不同區帶里的各個組份。延長離心時間，這樣大小相近的顆粒也會沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。