10) 移卵操作完成后,撤回移卵管,去除器械,按原本位置將各器官重置于腹腔內。
10)縫合切口,用小夾夾持皮膚。常用自動小夾代替縫線,這樣可以避免小鼠啃嘶縫線,切口裂開。
11)若進行雙側手術,則于另一側子宮角重復上述操作。
12)手術完成后,安置小鼠于清潔的籠中。麻醉狀態下,小型哺乳動物無法有效維持機體溫度。所以應該注意小鼠的保溫。可以用熱墊保持其溫度直到動物蘇醒。所有的動物在回籠前20-30分可蘇醒。由于妊娠很容易使受體母鼠產生應激反應導致流產或食子,所以對受體母鼠必須嚴格監護。
(2)注射后期監護:手術后嚴格監護防止并發癥的發生非常重要。麻醉易誘導小鼠出現血壓升高,所以手術后必須嚴密監護至少2小時,同時推薦進行保溫處理。
處于麻醉狀態的小鼠應該用軟紗布包裹,而且籠中加墊草墊以及軟材料,并保持鼠籠溫度。正常體溫的維持可以縮短動物處于麻醉狀態的時間。
手術后小鼠常規4-5天觀察一次以確保小鼠處于恢復中,清醒小鼠應活動自如。腹腔手術后小鼠有發生腸疝的可能。所以手術時保持切口盡量小,縫合嚴密,而組織膠水的正確應用可以避免此類并發癥的發生。皮膚必須用縫線或不銹剛夾夾閉,手術后1-2周可拔除。如果動物狀態不良,表現厭食,脫水,或明顯弓背,通過動物飲水可給予羥苯基乙酰胺以及同類止疼藥。若發生脫水,可腹腔注射0.9%生理鹽水或林格氏液。若仍無改善可在麻醉狀態下重新打開手切口確認是否有疝發生。若動物狀態無明顯好轉,最終采用安樂死進行。
(四)轉基因小鼠的鑒定
產出的鼠仔中,屬轉基因小鼠者,約占全部仔小鼠的20%-30%。因此,對轉基因小鼠必須進行鑒定篩選。
1. 轉基因整合檢測
鑒定轉基因小鼠最簡單的方法是從小鼠尾尖提取基因組DNA,檢測其基因型。檢測方法包括PCR和Shouthern 雜交。
(1) 基因組DNA的提取:
1) 將離乳期小鼠(>4周齡)麻醉標記。
2) 用一只手抓住小鼠,另一只手持消毒剪剪下約1cm的鼠尾。
3) 將剪下的鼠尾放入500?l消化緩沖液中(50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS), 并加入蛋白酶K使其終濃度為100 ?g/ml,550C下震蕩孵育3~4 小時或過夜孵育。
4) 加入5 ?l RNA酶A,370C孵育1~2小時。
5) DNA的分離純化步驟參見第一章的第三節。
(2) PCR檢測: 轉基因的初始篩選通常采用PCR檢測技術。該技術操作簡便、快速、費用低而有效,適合大量標本的分析。由于該技術特別敏感,可能產生假陽性結果。因此,在操作過程中必須特別小心,避免質粒DNA或其它標本的基因組DNA的污染。假陽性的產生對轉基因小鼠的篩選工作將是致命的。PCR實驗應采用雙復管,甚至三復管。陽性結果最好用Southern雜交技術進一步證實。
PCR的實驗操作參見第一章的第六節。
(3) Southern blot分析:該技術雖然沒有PCR技術那樣敏感,且費力費時,但是避免了因污染導致假陽性結果的麻煩,可以得到目的基因整合后的基因組、整合位點數目、轉基因拷貝數等的確切信息。Southern blot的實驗操作參見第一章的第八節。
2. 轉基因表達檢測
轉基因整合檢測是確定目的基因是否整合到了小鼠的基因組中,同時可確定整合的位點和拷貝數,這在遺傳學上是十分重要的。而轉基因表達檢測是確定目的基因在轉基因小鼠器官組織中表達的時空分布。其檢測包括RNA分析技術和蛋白質檢測技術。