轉基因斑馬魚的構建

實驗概要

本實驗對斑馬魚導入含 EGFP的質粒，觀察其在動物體內的表達情況，在斑馬魚體內，綠色熒光蛋白從原腸胚到出苗期均能在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。

主要試劑

EGFP、綠色熒光蛋白基因、pEGFP-N2載體、E.coli

主要設備

試管、試管架、可調式微量加樣器、電泳儀、電泳槽、染色缸、42℃恒溫水浴箱、冰浴、恒溫振蕩箱、超凈工作臺、手動顯微注射器、體式顯微鏡、硼硅酸玻璃毛細管、倒置顯微鏡、攝像系統(CCD)、自動水循環系統一套，孵化水槽、培養皿、解剖鏡、小規模質粒提取試劑盒

實驗步驟

1. 轉染細菌的培養

   1) 培養基的制備：稱取胰蛋白胨 3g，酵母提取物 1.5g，NaCl 3g，于一500 mL 的三角瓶中，加入蒸餾水至 300 mL 溶解。若配制固體培養基，則需加入 4.5 g 瓊脂(1.5%)，然后用 NaOH 調 pH 至 7.5。分裝于 3 個 250 mL 的三角瓶中，加塞，包扎。

   2) 培養基的滅菌與消毒：在滅菌鍋中，加入適當的水，放入已包扎好的培養基，蓋好蓋子，加熱。當壓力升至 0.05 MPa 時，打開放汽閥，排除冷空氣，當壓力回到 0 時，關閉放汽閥，當壓力升至 1.034 MPa 時保持 15-30 分鐘后，停止加熱，壓力降為 0 時，打開放汽閥排汽取物。

   3) 含 Amp 的 LB 固體培養基：將配好的 LB 固體培養基高壓滅菌后冷卻至 60℃左右，加入 Amp(氨芐青霉素)儲存液，使終濃度為 50 μg/mL，搖勻后鋪板。

   4) 接種加甘油保存的分別含質粒的 Ecoli.，每管接種體積為 10 微升。

   5) 37℃搖床過夜培養 24h.

2. 質粒的小量提取

   1) 樣本處理：收集已培養12～16 小時的菌液13ml，12000rpm 離心1 分鐘，盡量吸除上清。

注：菌液較多時可以通過多次重復離心將菌體收集到1 個離心管中。菌液收集量由菌濃而定，收集菌體過多會反而降低裂解效果。

   2) 懸浮：向菌體沉淀的離心管中加入250ul 溶液Ⅰ，用移液器反復吹打或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。

   3) 裂解：加入250ul 溶液Ⅱ于細菌懸液中，溫和地上下顛倒6～8 次，使菌體充分裂解，加1 管混合1 管，確保溶液充分、及時的混勻。充分裂解后的菌液會變得相對粘稠；為防止DNA 斷裂，避免劇烈混勻操作及裂解時間過長。

   4) 中和：加入350ul 溶液Ⅲ，立即溫和上下顛倒6～8 次，充分混勻，加1 管混合1 管。此時會出現白色絮狀沉淀，靜置2 分鐘，12000rpm 離心5分鐘(可適當延長至10min)。

注：溶液Ⅲ加入后應立即混勻，避免產生局部沉淀。若上清液中仍存在微小白色沉淀，可重復離心后取上清。

   5) 吸附：小心地將上清液轉移至吸附柱中，12000rpm 離心 30～60 秒，棄收集管中廢液，然后將吸附柱重新套入廢液收集管中。若上清一次加不完，可重復操作(轉移時不可吸入沉淀，此步很重要)。

   6) 漂洗：向吸附柱中加入 600ul 漂洗液 PW(使用前請檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm 離心 30～60 秒。

   7) 重復步驟 6，棄收集管中廢液。

   8) 將吸附柱套于收集管中，10000rpm 離心 2 分鐘。

注：此步驟絕對不可省略，目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液，因為漂洗液中乙醇的殘留會影響后續實驗(酶切，PCR 等)。

   9) 洗脫：將吸附柱置于一干凈的 1.5ml 離心管中，向吸附柱膜中央部位懸空滴加 50～100ul 溶解液 TE 或滅菌雙蒸水(pH值在7.0-8.5)，室溫靜置 2～10 分鐘，12000rpm 離心 2 分鐘，即得提取質粒 DNA，-20℃保存。

3. 將提取出的質粒雙酶切，將其線性化并導入熒光蛋白基因，經 1.0%瓊脂糖凝膠電泳，得到一大小為 6.0 kb 的帶，將起切下純化并回收。

4. 采用光周期誘導方法得到斑馬魚受精卵。

5. 受精后第一次卵裂前進行基因注射，每次注射的 DNA 溶液約 1-2 nL。轉基因受精卵置于 Holtfreter’s 于室溫培養，適時更換培養液，待胚胎發育至原腸期后，將培養液逐漸用暴氣的冷開水稀釋，發育至心跳期以后，將胚胎轉移到暴氣的冷開水中培育。

6. 在 480nm 激發光照射的熒光倒置顯微鏡下觀察 EGFP 在轉基因斑馬魚胚胎中的表達。