轉染和轉染效率測定步驟

LIPOFECTAMINE 2000轉染試劑轉染步驟

此實驗步驟設計用來進行24孔板貼壁細胞的瞬時或穩定轉染，其為設計用來在生長培養基中直接加入復合物。
1. 轉染前一天，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養基中。
2. 對于每孔細胞，使用50μl無血清培養基（如OPTI-MEMⅠ培養基）稀釋0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制備。
3. 對于每孔細胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培養基稀釋1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000試劑。LIPOFECTAMINE 2000稀釋后，在30分鐘內同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。可以批量制備。
注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細胞也可以使用D-MEM培養。如果D-MEM做為LIPOFECTAMINE 2000的稀釋液，在5分鐘內同稀釋的DNA混合。
4. 混合稀釋的DNA（由第2步）和稀釋的LIPOFECTAMINE 2000（由第3步）。在室溫保溫20分鐘。
注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉染。復合物可以在室溫保持6小時穩定。

表6. 在24孔板中轉染Invitrogen細胞系的推薦使用量 Table 6
Cell Line Cill/well(×10) LIPOFECTAMINE 2000 Reagent(μl)
CHO-S 1.5 2.5-3.0
COS-7L 0.8 2.5-3.0
293H,293F 2.0 1.5-2.0

5. 直接將復合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。
注意：如果在無血清條件下轉染，使用含血清的正常生長培養基進行細胞鋪板。在加入復合物前移去生長培養基，替換為0.5ml無血清培養基。
6. 在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時，無須去掉復合物或更換培養基或者在4-5小時后更換生長培養基也不會降低轉染活性。
7. 在細胞中加入復合物24-72小時后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩定表達，在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。
貼壁哺乳動物細胞的DNA轉染步驟

此步驟專門設計使用LIPOFECTAMINE，LIPOFECTIN，DMRIE-C或CELLFECTIN試劑在6孔板轉染貼壁的哺乳動物細胞。
使用這些試劑時，欲得到最佳轉染效率，條件的優化必不可少。參考右側陽離子脂質體試劑和DNA優化步驟。健康的，正在增生的細胞和恒定的細胞密度對于可重復性的結果不可或缺。

1. 轉染前一天，將細胞用胰酶消化、計數并鋪板，使轉染日細胞融合度為70-90％。在鋪板和轉染期間避免使用抗生素。
2. 對每孔細胞，在100μl無血清培養基（如OPTI-MEMⅠ或D-MEM）中稀釋1-2μg DNA。如有多孔細胞，可以批量制備。
3. 在每孔中，用100μl無血清的培養基稀釋2-25μl陽離子脂質體試劑。陽離子脂質體試劑的每次稀釋都使用單獨的管。對于LIPOFECTIN，必須使用OPTI-MEMⅠ稀釋并將稀釋液在室溫保溫30分鐘。
4. 將稀釋的DNA（步驟2）同稀釋的脂質體試劑（步驟3）混合。在室溫保溫15分鐘。
5. 使用0.8ml/孔的轉染培養基在轉染開始前清洗細胞。轉染培養基中可以含有血清。
6. 使用轉染培養基稀釋復合物至總體積1ml/管。將稀釋的復合物加入細胞。5% CO2，37℃保溫5小時。
7. 5小時后，增加培養基的體積至正常體積。如果轉染培養基不含血清，加入血清，使其終濃度達到正常生長培養基的濃度。如欲使細胞生長最佳，使用新鮮的完全培養基替換含有復合物的培養基。
8. 轉染24-48小時后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩定表達，在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。
注意：當轉染不同大小培養板中的細胞時，根據表面積相應改變細胞，DNA，轉染試劑以及培養基的量。

陽離子脂質體試劑和DNA的優化步驟

當使用除LIPOFECTAMINE PLUS試劑外的其他陽離子脂質體試劑進行轉染時，如欲得到最佳轉染效率，精心的優化必不可少。本實驗步驟可以確定使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE試劑所需的最佳脂質體試劑和DNA的量。

保持恒定的細胞密度以得到可重復的結果。陽離子脂質體試劑和DNA復合物在96孔板中制備（因為體積很小），然后加入24孔板中生長的細胞。轉染的培養板按如下方式設置：

1. 轉染前一天在24孔板中進行細胞鋪板，使轉染日細胞融合度為70-90％。
2. 在6個小離心管中，根據下表使用無血清培養基稀釋陽離子脂質體試劑（其足夠用于5孔細胞轉染）。僅對LIPOFECTIN試劑，需要在室溫保溫稀釋液30分鐘。

Tube/Colum(μl) Volume Dilution Medium(μl) Volume Cationic Lipid Reagent
1 120 5
2 117.5 7.5
3 115 10
4 112.5 12.5
5 110 15
6 107.5 17.5

3. 將25μl稀釋的陽離子脂質體試劑（步驟2）加入96孔板相應列的4個孔中（如上面圖表）。
4. 在小離心管中，在140μl無血清培養基中加入下列量的DNA進行稀釋。（足夠用于7孔細胞轉染。）

Tube/Row DNA(μg)
A 1.4
B 2.8
C 5.6
D 8.4

5. 在96孔板上每隔6孔（沿底部），在管A取出20μl加入。對管B，C和D重復同樣步驟。將樣品按上面圖表所示排布。在室溫保溫15分鐘。
6. 將要轉染前，使用新鮮轉染培養基清洗細胞。在加入稀釋的復合物（步驟7）前除去清洗液。
7. 在含有DNA-陽離子脂質體試劑復合物的96孔板上，每孔加入160μl轉染培養基（含有或不含有血清）。稍加混合。建議檢測有無血清存在時的活性。
8. 將復合物加到24孔板的細胞中。
9. 5%CO2，37℃保溫5小時。5小時后，加入含血清的完全培養基，使血清終濃度等同于正常生長培養基。如欲使細胞生長最佳，使用新鮮的完全培養基替換含有復合物的培養基。
10. 轉染24-48小時后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩定表達，在開始轉染一天后將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天后加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。

注意：一旦確定了優化的條件，轉染實驗可以根據培養板表面積增加的比例線性放大。6孔板中得到的優化條件已經成功放大到100mm平皿上。建議的陽離子脂質體和DNA量的范圍列在下面。

表11. 使用LIPOFECTIN，CELLFECTIN，DMRIE-C或LIPOFECTAMINE試劑進行轉染的用量范圍 Table 11
Culture Vessel DNA(μg) Cationic Lipid Reagent(μl) Transfection Medium Volume
35-mm 1-2 2-25 0.8
60-mm 3-6 6-75 2.4
100-mm 8-16 16-200

轉染細胞的β-gal原位染色

1. 此實驗步驟針對固定細胞β-gal表達的檢測。這是用來確定轉染效率的方便快捷的方法。此方法在6孔板上進行，由Sanes的方法修正而來。對于不同大小的培養器皿，根據培養板的表面積比來擴大或縮小溶液的量。此步驟可以用于懸浮細胞。使用2×106轉染的細胞（來自6孔板轉染），輕輕將細胞離心下來，使用和培養板上潤洗細胞相同的方法。輕柔地處理細胞，不能振蕩，并以盡可能低的速度離心。

貯液：
20mg/ml的X-gal溶解于二甲亞砜（－20℃，貯存于聚丙烯試管中，避光）。
注意：用玻璃移液管或者聚丙烯吸頭來定量二甲亞砜溶液。二甲亞砜能溶解聚苯乙烯。
50mM鐵氰化鉀（貯存在4℃）。
50mM亞鐵氰化鉀（貯存在4℃）。

工作液：
固定液：含有2%甲酰胺，0.05％戊二醛D－PBS（貯存于4℃）

配制方法如下：
85ml蒸餾水
10ml不含鈣和鎂的10X D－PBS（Cat.No.14200-075）（27mM KCl，11mM KHPO4，1.4mM NaCl，81mM Na2HPO4·7H2O）
5ml福爾馬林（37％甲醛溶液）
0.2ml戊二醛（25%溶液）

染液：含有5mM 鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，2mM氯化鎂的D－PBS（貯存在4℃）。
配制方法如下：
70ml蒸餾水
10ml 10×D-PBS
10ml 50mM 亞鐵氰化鉀
10ml 50mM 鐵氰化鉀
0.2ml 1M 氯化鎂
底物/染液：染液含有1mg/ml X-gal
以下試劑即配即用：
20ml染液
1ml X-gal（20mg/ml）

步驟：
1. 用質粒pCMV·SPORT-βgal轉染，使其表達24小時以上。
2. 每孔用2ml含有鈣鎂的D-PBS（Cat.No.14040-133）洗細胞一次。
3. 在室溫用1ml固定液固定細胞5分鐘。
4. 每孔用2ml D-PBS洗兩次。
5. 每孔加入底物/染液溶液1ml并在室溫或者37℃溫育2小時至過夜。
6. 每孔加入2mlD-PBS潤洗，在倒置顯微鏡下觀察細胞，并估計藍色細胞（β－gal－陽性）的比例。
7. 如要保存培養板，每孔中加入1ml含有10%福爾馬林的PBS，室溫放置10分鐘。用D-PBS潤洗后4℃保存在PBS中。

在轉染細胞抽提物中測定β-gal表達

此實驗方法用于測定細胞抽提物中β-gal活性。可以測定從96孔板到100mm培養皿轉染所得的活性。此方法可適用于懸浮細胞（參見步驟2注意事項）。

溶液
裂解液：0.1％ Triton X-100/0.1M Tris-HCl（pH8.0）。
450ml蒸餾水
50ml 1M Tris-HCl（pH8.0）
0.5ml Triton X-100去垢劑
100×Mg溶液
0.1M氯化鎂
4.5M 2-巰基乙醇
4℃保存

0.1M磷酸鈉（pH 7.5）
41ml 0.2M Na2HPO4
9ml 0.2M NaH2PO4
50ml蒸餾水

4mg/ml ONPG（o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）溶于含有2mM 2-巰基乙醇的0.1M磷酸鈉（pH 7.5），4℃儲存。

1M 碳酸鈉水溶液

使用GENETICIN?篩選抗生素篩選穩定轉染株

篩選所需的GENETICIN抗生素的量會因細胞類型，培養基和血清成分的不同而不同。另外，如果使用粉末GENETICIN抗生素，則需要計算每批抗生素的劑量，因為效價會波動。或者使用GENETICIN抗生素溶液，其活性會為100%。

一般使用100到1100μg/ml的GENETICIN抗生素濃度篩選穩定的轉染株，使用一半的篩選劑量保持培養的抗性。在轉染前，使用您的細胞進行一個劑量-反應分析以確定殺死細胞的最低抗生素濃度。可以使用稍高的濃度篩選穩定的轉化子。

制備儲液：50mg/ml
1. 樣品計算：
標記效價：700μg/mg
如配制10ml，需要500mg活性藥品。因此需要的總的干重為714mg。
2. 稱量714mg GENETICIN抗生素。
3. 溶于10ml蒸餾水。
4. 無菌過濾。

或者，可以使用即時可用的溶液（無菌過濾），全效價為50mg/ml活性抗生素。

劑量-反應分析：
1. 制備不含青霉素或鏈霉素的完全培養基。
2. 加入0到22μl 50mg/ml的GENETICIN抗生素溶液（終濃度為0至1100μg/ml完全培養基，以100ug/ml梯度增加）。
3. 使用胰酶消化細胞，稀釋到4000細胞/ml。
4. 在6孔板的每孔中加入100μl細胞懸浮液，每孔中已預先加入2ml含稀釋GENETICIN抗生素的培養基。將培養板在濕潤的5%CO2中37℃溫育。每周使用含GENETICIN抗生素的新鮮培養基更換培養基兩次。
5. 在10到14天，除去培養基，使用含鈣離子和鎂離子的D-PBS清洗細胞。使用溶于50%甲醇的0.5%亞甲基藍染色細胞20分鐘。
6. 確定殺死所有細胞的GENETICIN抗生素最低濃度。使用緊鄰的稍高的濃度進行篩選。

轉染和篩選：
1. 使用含編碼抗生素抗性基因表達序列的質粒（如pSV2neo）轉染細胞。
2. 轉染后第二天，將細胞傳代，給細胞分裂的空間（根據細胞生長的速度，一般1:10到1:40可以達到效果）。
3. 轉染后2-3天，開始使用抗生素。將轉染的細胞在含抗生素的培養基中培養，抗生素的濃度由劑量-反應分析確定。含抗生素的培養基每周更換兩次。
4. 10到14天后，可以觀察到抗性克隆，未轉染的對照應該沒有細胞生長。可以根據需要固定，染色，傳代或克隆抗性細胞。