轉運反應成分的制備實驗

APC 懸浮液 HEPES NaCl SMCC

微量離心管 Sephadex G50 脫鹽柱

1. 在一微量離心管中，4℃，10000 g 離心 APC 懸浮液 5~10 分鐘，吸走上清。

2. 用 0.1 mol/L HEPES（pH 7.4），0.1 mol/L NaCl 重懸浮沉淀至濃度為 5 mg/ml。用這種緩沖液透析幾次去除殘留的硫酸銨。

3. 臨用前用透析液溶解硫代 SMCC，濃度為 10 mg/ml。

4. 按 0.1 mg 硫代-SMCC/1 mg APC 的比例將硫代-SMCC 加到蛋白質中，冰上孵育 45 分鐘。

5. 將修飾后的 APC 過一 5 ml 的 Sephadex G50 脫鹽柱，柱子預先用 0.1 mol/L HEPES，(pH 7.4)，0.1 mol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA 平衡。

6. 通過真空透析或用一離心濃縮裝置將 APC 濃縮為 5 mg/ml。

7. 用含 0.4 mmol/L 的三（2-羧乙基）鹽酸磷的 G50 柱緩沖液溶解要偶聯的肽。

8. 按 1~5 倍的摩爾比例將肽加到含有被修飾的 APC 的試管中，TCEP 的終濃度應為 0.1 mol/L 4℃ 溫和攪拌過夜。

9. 加入半胱氨酸至 5 mmol/L 以封閉交聯劑中沒反應的 APC-馬來酰亞胺基團，4℃ 孵育 1 小時。

10. 用 Sephadex G50 脫鹽柱或離心濃縮器將 APC-肽聚合物與自由肽分離開來。

11. 將 APC-肽濃縮為 1~2 mg/ml，分成小份在液氮中冷凍，-80℃ 保存。