輪狀病毒感染小腸絨毛（villi）的腸黏膜細胞，改變上皮組織的結構與功能。 輪狀病毒的三重蛋白質外層使它們可以抵抗胃中的胃酸以及消化系統中的消化酶（digestive enzyme）。
病毒借由受體媒介的內吞作用進入細胞，并且形成一個稱作核內體（endosome）的囊泡。輪狀病毒第三層的蛋白質（即VP7與VP4刺突）會分解核內體的外膜，而創造一個鈣濃度不同的外膜。這個改變導致了VP7蛋白質三聚體破裂為一個單一蛋白質的子單元，留下圍繞在病毒雙鏈核糖核酸外面的VP2與VP6蛋白質，形成雙層構造的病毒顆粒（DLP）。
七條雙鏈核糖核酸鏈依舊維持兩層蛋白質層，并提供病毒核糖核酸依賴性的核糖核酸聚合酶（RNA replicase或RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）創造雙鏈病毒基因體的信使核糖核酸轉錄復本的保護。借由把病毒核糖核酸保持于病毒核心，病毒核糖核酸躲避了先天宿主的免疫反應。這個免疫反應稱為核糖核酸干擾，會因為雙鏈核糖核酸鏈的表現而觸發。
在感染的過程中，輪狀病毒產生信使核糖核酸來生物合成蛋白質并且進行基因復制。大部分的輪狀病毒蛋白質都堆積在病毒質中，病毒質也是核糖核酸復制的地方，以及雙層構造病毒顆粒組裝的地方。病毒質于病毒感染細胞約兩個小時之內就會快速地在細胞核周圍形成，而組成所謂的“病毒工廠”，這個病毒工廠是由兩個病毒非結構性蛋白質（NSP5與NSP2）所制成。NSP5蛋白質如果因為核糖核酸干擾而被壓抑功能，會明顯地減弱輪狀病毒復制功能。新生的雙層構造病毒顆粒則會移動到內質網，它們將在此處獲得它們第三層外層（由VP7與VP4蛋白質所構成）。最后，這些后代病毒就會經由細胞裂解（lysis）釋放到細胞之外。