輕松實現液相色譜的方法轉換（二）

然后將方法轉換到填充1.7μm填料的內徑為2.1mm 的BEH C18 柱上。為了保持兩個柱子上的線速度相同，將流速減小到0.22 ml/min，同時將進樣量從2μl減少到0.8μl，壓力為380bar。為了補償延遲體積的差異，在梯度中引入了0.5min的初始持續時間。這些條件下的結果與用3.5μm 填料色譜柱非常相似（圖1B），但得到結果（圖1A）的速度稍快。

使用1290 Infinity LC設置，柱效和分離度明顯提高。理論塔板數可以用柱長與2倍粒徑之比進行粗略計算。因此，1.7μm 填料柱的柱效應為3.5μm 柱的兩倍。由于分離度與柱效的平方根成正比，所以，在同一系統上分離度應提高1.4 倍。在這個特例中，分離度的提高比理論預計高得多（例如峰1和峰2的分離度從2.6提高到5.9）。這歸功于Agilent 1290 Infinity LC系統更低的死體積和更卓越的泵驅動。

1290 Infinity LC系統提高分析速度

在1.7μm粒度色譜柱進行分析時壓力是380 bar，遠遠低于1290 Infinity LC系統泵的1200 bar的壓力上限。因此，還可以通過增大流速來縮短分析時間。當增大流速時，為了保持相同的洗脫曲線，應按流速的增加比例縮短梯度時間。

當流速從0.22ml/min加快到0.66 ml/min時，操作壓力從380 bar增加到了1020 bar。正如預期的一樣，色譜柱在非常高的壓力或高流動相線速度條件下，產生了摩擦熱。由于分析物中某些組分的保留與溫度有關，所以我們注意到，在高流速下色譜柱的選擇性有所不同。可以看出，主成分和化合物5之間、化合物7 和8的分離度尤其受溫度變化的影響（圖2A）。

將柱溫從37℃降低到32℃，可以抵消熱效應（圖2B）。在該條件下，在4.5~5min內就可實現良好分離，與原來的LC相比，時間縮短了3 倍。然而當壓力增加到1070 bar時，所用色譜柱卻只能耐受1000 bar 的壓力。色譜柱在比最大耐受壓力更高的壓力下使用更長時間后，柱壽命和方法的耐用性會明顯降低。

因此，對于常規應用，若柱長從150 mm減少到100 mm，在0.66 ml/min 流速下形成的最大反壓為880 bar。進一步縮短梯度持續時間和梯度時間來保持原方法的選擇性。該方法總分析時間是3.5min，而原來用3.5μm 粒度色譜柱時總分析時間為15.5min（圖3）。初始峰的分離度是3.8，這仍比用1200 系列LC系統得到的數值高。

方法驗證

采用圖3的條件，測定了線性、進樣重現性和檢測限（表4）等參數。得到良好的線性（所有化合物均大于0.999）和進樣精度。RSD 在0.005% 左右，接近檢測限（LOD）的某些化合物的RSD 均低于8%，大多數化合物的RSD 低于3.5%。這都在該濃度水平的合格限內。在LOD 分析的色譜圖見圖4。LOD 相對于主要化合物（柱上50–250 pg）， 在0.001% w/w 到0.005% w/w 之間波動。這說明，雜質水平低于報告閾值10 到50 倍時仍可被檢測到。

結論

本應用報告證明了將現有HPLC方法轉換為Agilent 1290 Infinity LC系統方法的可行性。開始，我們將在1200 系列LC上建立的HPLC 分析方法簡單移植至1290 Infinity LC系統上。如果考慮了某些儀器特征，該方法轉移將相對簡單。然后把原來的色譜柱（150 mm × 3.0mm，3.5μm 粒度）換成粒度更小的（1.7μm）窄內徑（2.1mm）柱。此轉換使化合物之間的分離度顯著增加。使用小于2 μm 填料的色譜柱可以通過提高流動相的線速度縮短分析時間，而且不會影響分離度。在高壓和高流動相流速條件下產生的摩擦熱改變了方法的選擇性。為了維持原來的選擇性，將色譜柱溫度的設置降低。

最終的Agilent 1290 Infinity LC系統分析是在100mm柱上進行的，壓力為880 bar，比原來的HPLC 方法快4倍。該Agilent 1290 Infinity LC系統方法已得到成功驗證。檢測限隨著相當于柱上50~250 pg 的主化合物在0.001%w/w 到0.005%w/w 之間變化，這比要求的報告濃度水平低10~50倍。