實驗方法原理 利用蛋白質分子或其他兩性分子的等電點的不同，在一個穩定的、連續的、線性 pH 梯度中進行蛋白質的分離和分析。所以利用等電聚焦技術分析的對象只限于蛋白質和兩性分子。分析的條件是凝膠中有穩定的、連續的和線性的 pH 梯度。
試劑、試劑盒 丙烯酰胺單體貯液過硫酸銨貯液
儀器、耗材 注射器水浴
實驗步驟
一、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦
1. 制膠
(1) 灌膠模具的準備
使用商品膠既方便又迅速，重復性也好，但價格昂貴，所以一般實驗室均自己制膠。目前制膠有三種方法：蓋板法、平移法和毛細管灌膠法。
蓋板法：蓋板法制膠簡單，就像制作顯微鏡觀察用的樣品一樣。在載玻片上倒一定量的膠，用蓋玻片蓋上即可。所以操作方便，但重復性很差，且不宜制作大尺寸的凝膠。模具可以在實驗室自己制作。
平移法：采用原瑞典 LKB 公司的 Ultromould 模具即可進行平移法灌膠，使用此模具操作最為方便，也極易成功， 但模具價格昂貴，且凝膠的大小和厚度都受模具限制。
毛細管灌膠法：與前兩種方法相比，不但模具簡單，而且凝膠厚度、大小都可由自己制作的模具來控制，灌膠方法也很易掌握。作者實驗室現均用自己制作的模具。毛細管灌膠模具由兩個夾子和兩塊玻璃板組成。其中稍短的玻璃板的兩側貼有一定厚度的邊。玻璃板的大小根據欲制凝膠的大小而定。
在潔凈，帶邊的短玻璃板上倒少許疏水硅烷，用軟紙或棉花在玻璃板上涂布均勻。在不帶邊的長玻璃板上放一塊塑料支持膜，使膜緊貼玻璃。也可用 1 mm 厚的平整玻璃或用浸濕的玻璃紙替代。蓋上帶邊的短玻璃板，在玻璃板的帶邊側分別用夾子夾緊。組裝好的模具水平放置，準備灌膠。
(2) 溶液配制
丙烯酰胺單體貯液：溶解 14.55 g 丙烯酰胺和 0.45 g N,N'-甲叉雙丙烯酰胺在 35 ml 蒸餾水中，攪拌，直至溶解，用蒸餾水加至 50 ml。過濾，溶液可在 4℃ 保存兩周。
10% (W/V) 過硫酸銨貯液：溶解 0.1 g 過硫酸銨在 1 ml 蒸餾水中，溶液必須新鮮配制。
(3) 灌膠和取膠
用帶有橡皮管的注射器吸取抽濾瓶中的溶液，從模具的一端均勻緩慢地注入模具的玻璃板之間。為防止凝膠溶液灑在實驗臺上，也可將模具放在盤中。
凝膠聚合約需 40 分鐘~1 小時。聚合后，可在模具的帶邊側看到光的折射，即可取膠。將一薄刀插入底層玻璃板和塑料支持膜之間，輕輕地撬一下，底層玻璃和塑料支持膜隨即分開。小心地用薄刀先沿玻璃板的邊緣從玻璃板上將凝膠剝離，然后剝開帶有支持膜的整張凝膠。聚合后的凝膠可立即使用，也可保存在 4℃ 冰箱中備用，但需保持一定的濕度。
2. 等電聚焦
打開循環水浴，設置冷卻溫度。一般為 4~15℃，視室溫而定。室溫低時， 采用低一些的冷卻溫度。反之，室溫高時或系統中有尿素時，采用高一些的冷卻溫度。將制好的聚丙烯酰胺凝膠鋪在冷卻板上，其間涂以液體石蠟或煤油并避免氣泡陷入，以保證膠板和冷卻板之間的良好接觸。
用合適的電極溶液潤濕濾紙電極條。不同 pH 范圍的陽、陰極電極溶液可按 表 6.3 選用。在凝膠兩側分別放置陽、陰極濾紙條。有的儀器采用粗電極與凝膠直接接觸的方式，則不需加濾紙電極條。
按冷卻板上的格子和預先設計的實驗計劃將樣品加在凝膠上。微量樣品 ( < 3 μl ) 可直接加在凝膠上，稀樣品加在加樣濾紙上，等電點標準加在兩側或中間。根據等電聚焦的原理，樣品可加在凝膠上任何合適的位置，濃度一般為 0.5~2 μg/μl。
將電極分別放在濾紙電極條的中心，再將陽極和陰極分別與電源的正、負極相連。接通電源。電參數參見表 6.4。注意確保電極和電極條的良好接觸。電泳半小時后，去掉加樣濾紙。對容易變性的樣品，先進行 15~30 分鐘的預聚焦，再加樣。
3. pH 梯度測定
pH 梯度測定有三種方法。
(1) 早期測定 pH 梯度的方法，特別是使用圓盤電泳時，是將切成一段段的凝膠浸泡在蒸餾水中（或 10 mmol/L 氯化鉀中)，然后測定浸泡液的 pH。
(2) 聚焦后，可用表面電極測 pH，按照冷卻板上的格子從陰極到陽極每隔 1 cm 測一值。為防止聚焦帶的擴散，測 pH 后，再重新聚焦 5~10 分鐘。然后在凝膠掃描儀，攝錄系統或坐標紙上畫 pH 梯度。
(3) 如果使用等電點的蛋白標準，則染色后根據其電泳帶的位置和等電點數據畫出 pH 梯度曲線。
4. 固定、染色、脫色
電泳結束后，棄去電極條，立即將凝膠放入固定液中固定 30 分鐘。棄去固定液，用脫色液浸洗凝膠 5 分鐘。棄去脫色液，將凝膠放入 60℃ 的染色液中 10 分鐘。棄去染色液，用脫色液洗膠，并用濕棉花輕輕地擦凝膠的表面。多次更換脫色液，直到凝膠的背景完全脫去藍色為止。溶液配方見表 6.5。這是快速考馬斯亮藍 R-250 染色方法。根據樣品性質和要求的不同，應采取不同的染色方法，“常規聚丙烯敢胺凝膠電泳” 中介紹的各種方法，甚至 “SDS聚丙嫌酷胺凝膠電泳” 中的部分方法均適用于等電聚焦電泳。但這些方法在等電聚焦電泳時，由于載體兩性電解質的影響，脫色比較困難，而且靈敏度也不如常規聚丙烯酰胺凝膠電泳和 SDS 電泳，如銀染法在 SDS 電泳時靈敏度可達 0.3 ng，但在等電聚焦時只能檢測 1~5 ng。
5. 保存
脫色后的凝膠放在保存溶液中半小時，取出晾在玻璃板上，用一張脫色液浸濕的玻璃紙包裹凝膠板，或待凝膠發黏后，壓一塊透明塑料膜，晾干，這樣一塊帶有染色蛋白帶的凝膠板便可以永久保存了。
二、瓊脂糖凝膠等電聚焦
瓊脂糖凝膠等電聚焦具有無毒性，電泳時間短，制膠、染色、脫色、保存容易的優點，并可以分離分析分子質量達百萬的化合物，在大分子質量分子的分離分析中具有獨特的地位。
1. 制膠
(1) 模具的準備
用與聚丙烯酰胺凝膠毛細管灌膠法相同的模具可以灌注瓊脂糖凝膠，但需使用與瓊脂糖粘著好的支持膜。組裝好的模具在 70℃ 烘箱中保溫 15 分鐘。
(2) 瓊脂糖溶液的配制
將 0.15 g 無電內滲瓊脂糖加在盛有 14.1 ml 蒸餾水的三角燒瓶中，在水浴上邊攪拌，邊加熱煮沸。瓊脂糖溶解后大約 10 分鐘，停止加熱，將水浴溫度降到 75℃ 。加 0.9 ml 欲要的 pH 范圍的載體兩性電解質到瓊脂糖溶液中混勻。從烘箱中取出模具。用一個帶橡皮管的注射器吸取溶液并灌注到兩塊玻璃板之間。灌注時，將模具的一端抬高成一定角度，以便溶液流入，灌注后立即將模具放在水平位置。
(3) 取膠
灌膠后在室溫放置至少 20 分鐘。用解剖刀切去兩頭多余的瓊脂糖膠。然后一手抓住上面的玻璃板和支持膜，另一手拿住底層的玻璃板，掰開，見圖 6.15。瓊脂糖凝膠固化后在冰箱中至少放 1 小時，使其充分凝固。在保持一定溫度的情 況下，可在 4℃ 保存一周。使用前用濾紙輕輕地吸去凝膠表面的水。否則電泳時會短路燒膠。
2. 等電聚焦
用與聚丙烯酰胺凝膠相同的方法進行等電聚焦。電極溶液和電參數分別參見表 6.6 和 6.7。
3. pH 梯度的測定
pH 梯度的測定同聚丙烯酰胺凝膠方法，但由于沒有瓊脂糖凝膠等電聚焦的蛋白標準，所以通常采用表面電極測定的方法。
4. 固定、染色、脫色、保存
聚焦電泳結束后棄去電極條，立即將膠放入固定液中固定 10 分鐘。棄去固定液，用 95% 乙醇洗 10 分鐘。用熱吹風將膠吹干。
將膠放在染色液中染 5 分鐘。染色后的膠用脫色液脫色。用棉花輕輕地擦膠的表面并更換脫色液，直到膠的背景完全脫去藍色為止。用熱吹風吹干就可永久保存。
上述是常用的考馬斯亮藍 R250 瓊脂糖凝膠染色方法，對不同的樣品和要求可采用不同的染色方法。由于瓊脂糖凝膠孔徑較大，脫色比較容易，見表 6.8。