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  • 發布時間:2020-09-14 16:41 原文鏈接: 辛酸/硫酸銨法提純IgG

    一、原理
     
    在酸性條件下( pH4.5),非1gG的蛋白成份(包括白蛋白,部分Ig),能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀,上清中剩余的蛋白主要為IgG,再用硫酸銨沉淀上清,即可獲得純度較高的IgG。辛酸/硫酸銨法比硫酸銨法能夠獲得更高純度的IgG。
     
    二、材料與方法
     
    1、材料
     
    (1)動物腹水
     
    (2)辛酸(caprylic acid,CA),化學純
     
    (3)硫酸銨,分析純
     
    (4)SPA Sepharose 4FF親合層析柱
     
    2、操作方法
     
    (1)蛋白含量測定
     
    紫外分光光度法測樣品在波長260nm,280nm處的I及收光度(A 260, A 280),蛋白含量按以下公式計算
     
    蛋白量(g/L)=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀釋倍數
     
    (2)主要步驟
     
    ①腹水濾紙過濾去沉淀和脂質,濾液用4倍體積60mmo1/ L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋后,用Na0H調,PH值至4.5。
     
    ②逐滴加入辛酸(終濃度25u1/ml),室溫h攪拌30分鐘后,以6000-8000r/min.離心30分鐘,收集上清液。


     
    ③上清液經濾紙過濾2次,將濾液與10*PBS(0.lmol/L,pH7.4按10:1比例混合,調pH至7.4,置冰浴冷至40度。
     
    ④每毫升上述混合液加0.2778固體硫酸錢,40度攪拌30分鐘,以4000-6000r/min離心巧一20分鐘,將沉淀溶于少量YBS,透析,測蛋白含量,凍存。
     
    (3)硫酸銨沉淀法
     
    按常規方法將腹水分別經50%,33%飽和度硫酸銨沉淀。
     
    (4)親合層析
     
    取提取的樣品,用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7.4)透析,洗脫使樣品中IgG結合于層析柱上,再用0. lmol/ L檸檬酸(pH4.0)洗脫,收集洗脫液即獲純化IgG。
     
    (5)SDS—PAGE電泳鑒定抗體純度
     
    (6)間接ELISA法測定抗體效價
     
    用sIgA包被酶標板,按常規方法測抗體效價。處理細胞,包被酶標板,測定抗體效價。
     
    (7)得率和回收率的計算
     
    每毫升原腹水中提取的抗體量即為得率(Y field,g/ L );提取所得抗體量與原腹水中抗體量之百分比即為回收率(Recovery,%)。


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