實驗概要
本實驗介紹了果蠅類標本的辣根過氧化物酶標記試劑染色檢測操作流程。
實驗原理
果蠅類標本被固定及透化處理后，可加入抗體。如同其他免疫組化技術一樣可以直接用標記的一抗，或者通過標記的二級試劑(能與一抗特異性結合)進行檢測。一般而言，直接標記一抗產生的信號更為清晰，背景較低。不足之處在于如檢測多種抗原，就需分別制備和純化相應的多種標記一抗。因此，除了特殊情況以外，一般推薦使用間接法，該法所需的二抗檢測試劑可從商業經銷處購買。
在大多數情況下推薦用酶標試劑，因其敏感度較高，使用普通的光學顯微鏡就可以觀察結果；如需要高分辨率或同時定位2種抗原時，推薦用熒光染料標記試劑，但其檢測需要使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。
在抗原制備過程中研究者常采用幾種方法固定果蠅類標本，這就使得抗原經受的處理更為強烈，通常會遇到較高背景的問題。在果蠅類標本的免疫組化染色中，為消除較高背景可將樣本與正常羊血清預先孵育。大部分標記二抗試劑是羊抗鼠或羊抗兔免疫球蛋白抗體。因而，最好選用非免疫羊的天然抗體來封閉非特異交互反應性位點，從而降低背景。此外，通過降低抗體濃度并孵育過夜亦可降低背景。
酶標試劑的檢測是利用可溶性的色原物質經酶促作用發生沉淀反應，在酶反應部位產生不溶性的有色物質。每種酶可利用一定范圍的底物，但對于原位染色，辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)適應大多數實驗的要求。HRP標記的各種試劑均可購買到。用HRP可以標記抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、蛋白G、親和素或鏈霉親和素等。
HRP標記的試劑：HRP的底物包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯奈酚和胺乙基卡巴砷，但在果蠅類免疫定位中最有用的底物是DAB／金屬鹽。DAB也是HRP最敏感的底物之一，可產生一種高密度的棕色物質，不溶于水和醇類。在大多數情況下，建議在DAB底物溶液中加入金屬離子，如加入金屬鹽類鈷、鎳等，可使其變得更加敏感，其反應產物是藍灰色至黑色，并且在水和醇中是穩定的。DAB／金屬鹽類染色適合于大范圍的標本檢測。
主要試劑
第一抗體溶液；第二抗體(多數來自商品試劑)；PBS；含1％正常羊IgG的PBS；二氨基聯苯胺(DAB)；0.05mol／LTris緩沖液(pH7.6)；0.3％(W／V)NiCl貯存液(溶于水中)；30％過氧化氫；50：50甘油：PBS混合物；70：30甘油：PBS混合物。
主要設備
解剖顯微鏡；光學顯微鏡(多數帶有相機，以便于拍攝結果)。
實驗材料
1．對照
特異性染色反應需要與對照進行比較。為了準確評價染色模式，應對來自同一種屬的兩種抗體進行比較。對于多克隆抗體來說，最好的對照是從用于制備特異性抗體的同一動物免疫前采集的血清，但亦可以使用來自相同種屬動物的非免疫血清。對于單克隆抗體來說，對照應該是與特異性抗體的來源相同；例如，雜交瘤細胞培養上清對比上清，小鼠腹水對比腹水，純化抗體對比純化抗體。對照抗體應該與特異性抗體的類和亞類相同。來自親代骨髓瘤的細胞培養上清不宜作為對照，因為其中不含抗體。適宜的對照雜交瘤細胞株可從美國ATCC或歐洲動物細胞培養保藏中心獲得。
此外，對二級試劑應進行檢測。當采用酶標染色檢測時，應設立不加任何抗體的酶反應對照。這將有助于證實任何內源性酶活性的存在和分布位置。
2．準備工作
進行抗體結合和檢測最重要的準備工作是進行一抗和二抗的滴度測定。雖然在下述方法中建議抗體的加入初始量，但在免疫染色中應調整一抗、二抗的用量，以便達到足以引起強大有效信號的最低濃度，以免發生非特異性染色。對每一種抗體(存在于蛋白緩沖液中，如1％IgG／PBS)做一系列稀釋度并觀察其對靶細胞的染色效應。1／3稀釋(一份抗體中加入兩份緩沖液)將接近其半對數值，并對所加入量進行合適的快速測定。對于第一抗體的每一個滴度測定應進行重復實驗。而二抗一旦確定其稀釋度，就可以作為該批抗體的標準用量。
如有可能，應該對攜帶所研究抗原基因缺失的果蠅類標本同時進行染色。這將為特異性抗體提供一個極好的遺傳對照。
實驗步驟
1. 樣品洗畢后，懸于含1％正常羊IgG的PBS中。在1.5ml錐形管中胚胎或其他樣品所占體積應少于50ul，或在5mlsnap-top管中應少于200ul。搖動孵育1h。
2. 用PBS洗2次。
3. 加一抗：用含蛋白質的溶液，如含羊IgG的PBS制備不同稀釋度的抗體。單克隆抗體最好來自雜交瘤細胞培養上清(特異性抗體濃度為20-50ug／m1；以1：10稀釋度作起點為佳)。小鼠腹水或純化的單克隆抗體和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應測試一定范圍內的稀釋度，從而使特異性抗體濃度達到0.01-1Pg／ml。如果特異性抗體濃度是未知的，應制備并測試原始制品的不同稀釋度(1：10，1：100，1：1000和1：10000)。
4. 在4℃孵育24h。
5. 用PBS洗3次，每次5min以上。PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以降低背景。
在此方法中，以未免疫的羊IgG作為封閉劑，即從正常羊血清中通過蛋白G純化制備。因本文推薦的標記二抗是羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗體，故選擇羊IgG作為封閉試劑。如使用的是另一來源的標記二級試劑，則應改用其他封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。
6. 加標記的二級試劑：用含蛋白質的溶液，如1％正常羊IgG／PBS制備不同稀釋度的二級試劑。常用的二抗試劑包括抗免疫球蛋白抗體、蛋白A或蛋白G。一般而言，建議使用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白二抗。標記的二級試劑可以購自供應商，如使用商業來源的標記二級試劑，其稀釋度可從1：50至1：1000。堿性磷酸酶標記的試劑應用Tris緩沖液稀釋，而不用PBS。
7. 加標記的二抗試劑，4℃孵育1h。
8. 用PBS洗3次，每次5min以上。PBS中可以含1％TritonX-100或NP-40，降低背景。
9. 將6mgDAB溶解在9m10.05mol／LTris緩沖液中(pH7.6)。
10. 加入lml 0.3％(W／V)氯化鎳貯液，也可用等量的氯化鈷替代。
11. 加0.1ml 3％過氧化氫溶液(用水配制)，通常供應的過氧化氫為30％，4℃下可保存1個月左右。
12. 如果有沉淀出現，可用Whatmanl號濾紙(或相應的)過濾。
13. 將底物溶液加至樣本中，孵育1-20min，用水沖洗終止反應。在顯微鏡下觀察顏色的變化以便判斷終止反應的適當時間。
14. 優化選擇：在高倍鏡下觀察胚胎時，胚胎的直觀視覺模式和通過胚胎的光路長度常引起標本出現不透明的現象。為了克服這一特點，通常用不同的試劑處理胚胎，這樣將能改變胚胎的折射指數。可將胚胎在甘油或甲基水楊酸鹽溶液中孵育。對于大多數染色標本以甘油效果較好。
將胚胎重懸于500ul的甘油／PBS(50：50)混合液中，于室溫下孵育1h。
離心胚胎，重懸于70：30的甘油／PBS混合液中。
經過甲基水楊酸鹽溶液處理的標本清晰度比甘油更好，但它易揮發，使一些工作者難于忍受這種氣味。此外，它沒有黏度，使得對胚胎的處理較容易。可先將胚胎通過一系列乙醇處理：50％乙醇5min，70％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇5min，各2次。再加500u1甲基水楊酸鹽溶液，作用10min，不應搖動試管。胚胎將沉到底部。去除上清并加新鮮的甲基水楊酸鹽溶液。最后用甘油代替甲基水楊酸鹽溶液。
15. 樣品觀察：將用甘油洗過的樣品轉到玻片上。在解剖顯微鏡下觀察胚胎，并挑選一部分在高倍鏡下檢查。
在一潔凈的載玻片上放2張蓋玻片(井1)，中間間隔lcm，以準備一個觀察小室。在這間隔區加上70：30的甘油／PBS溶液。由于毛細作用就可以使該溶液進入蓋玻片下。將所研究的胚胎轉至該觀察區，并蓋上第3張蓋玻片。應避免氣泡的形成。來回推蓋玻片，以便尋求到最佳方向進行觀察。
16. 觀察并照相。