過氧化氫酶活性測定公式計算方法

這樣應該可以了吧

一、實驗目的：
（1）掌握SOD酶的提取、分離、檢測一般步驟。
（2）了解酶在提取過程中的兩個參數：回收率、純化倍數。
（3）掌握離心機的使用。
二、實驗原理:
鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產物，中間物的積累在滯留30～45s后，與時間成線性關系，一般線性時間維持在4min的范圍內，中間物在420nm波長處有強烈光吸收。當有SOD存在時，由于它能催化O2-與H+結合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產物的積累，因此，通過測定光吸收即可求出SOD的酶活性。
三、實驗試劑：
大蒜、冷丙酮、磷酸緩沖液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液、鄰苯三酚、濃鹽酸、天平、石英砂、研缽、冷凍離心機、50mL離心管 8個、紫外-可見分光光度計、250mL三角瓶8個、玻璃棒8根、試劑瓶250mL 3個、500mL 3個、250mL燒杯16個、試管帶膠塞80根、移液管各5根
四、實驗步驟：
（1）SOD提取：
稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸緩沖液，研磨攪拌20分鐘，使SOD充分溶解，6000rpm離心，棄去沉淀，得上清液。(留出1mL備用，準確量取剩余上清液體積，記錄)
（2）除雜蛋白：
提取液加入1/4體積的氯仿-乙醇混合液攪拌10min，6000rpm離心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液備用,精確測量剩余粗酶液體積）
（3）SOD酶的沉淀分離：
剩余的粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000rpm離心15min，得到SOD酶沉淀。將沉淀先加2mL磷酸緩沖液，溶解后再加3mL混勻。6000rpm離心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL備用，其余量取體積。
（4）粗酶液活性測定：
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力檢測，具體步驟如下。
加入鄰苯三酚后迅速混勻，準確計時4min，加一滴濃鹽酸停止反應，420nm測吸光值。
試劑/（mL）
空白管
對照管OD1
提取液OD2
粗酶液OD2
酶液OD2
PH8.3緩沖液
3
3
3
3
3
SOD提取液
0
0
0.1
0.1
0.1
蒸餾水
2
1.8
1.7
1.7
1.7
室溫放置20min
鄰苯三酚
0
0.2
0.2
0.2
0.2
（5）溶液中可溶性蛋白含量測定：
分別從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍數稀釋，260nm/280nm測定吸光值，按公式計算蛋白質濃度。
提取液稀釋：50 ×
粗酶液稀釋：20 ×
酶液稀釋：10 ×
五、實驗數據：

提取液
粗酶液
酶液
總體積（ml）

提取液
粗酶液
酶液
260nm吸光度值

280nm吸光度值

公式
蛋白質濃度(mg/ml)=(1.45A280－ 0.74A260) ×稀釋倍數
蛋白質濃度（mg/ml）

對照管（OD1）
提取液（OD2）
粗酶液（OD2）
酶液（OD2）
420nm吸光值

六、實驗結果及數據處理：
（1）酶活力單位
提取液酶活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
粗酶液活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
酶液活力單位：=2（OD1-OD2）×5/0.1=
（2）總活力
提取液總活力U=活力單位×總體積=
粗酶液總活力=活力單位×總體積=
酶液總活力=活力單位×總體積=
（3）比活力
提取液酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質濃度=
粗酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質濃度=
酶液比活力U/mg=活力單位/蛋白質濃度=
（4）純化倍數
粗酶液純化倍數=粗酶液比活力/提取液比活力=
酶液純化倍數=酶液比活力/提取液比活力=
（5）回收率
粗酶液回收率=粗酶液總活力/提取液總活力=
酶液回收率=酶液總活力/提取液總活力=
七、實驗結果誤差分析：
（1）研磨和離心大概還不夠充分。
（2）由于測量儀器的精密度引起的誤差。
（3）在操作的過程中，加入鄰苯三酚后未混合均勻，可能致使化學反應進行得不很充分，這可能是造成實驗數據與預期不符的一個原因；
（4）在實驗過程中，所需化學試劑加入的量不是很準確，這可能是實驗數據出現問題的另一個原因；
（5）此外，實驗本身還很粗糙，酶的提取、分離和純化都不能十分徹底，還有很多雜蛋白干擾實驗。