ALS的診斷標準主要依靠臨床表現及肌電圖等輔助檢查結果。同時，因ALS為一類神經系統變性疾病，其診斷尚需除外其他可能引起類似ALS臨床表現的疾病。
目前，世界公認的ALS診斷標準是修訂的El Escorial標準，該標準于1994年由世界神經病學聯盟出于研究和臨床試驗目的而提出的，在認識到實驗室檢查的重要性之后，上述診斷標準于1998年被修訂，并提出了AirlieHouse診斷標準。2001年，中華醫學會神經病學分會參照世界神經病學聯盟的診斷標準提出了我國肌萎縮側索硬化的診斷標準（草案）。內容包括：
1、必須有下列神經癥狀和體征：
（1）下運動神經元病損特征（包括目前臨床表現正常，肌肉的肌電圖異常）；
（2）上運動神經元病損的體征；
（3）病情逐漸進展。
2、根據上述3個特征，可作以下3個程度的診斷：
（1）確診（definite）ALS：全身4個區域（球部、頸、胸、腰骶神經支配區）的肌群中，3個區域有上下運動神經元病損的癥狀和體征；
（2）擬診（probable）ALS：在2個區域有上下運動神經元病損的癥狀和體征；
（3）可能（possible）ALS：在1個區域有上下運動神經元病損的癥狀和體征，或在2-3個區域有上運動神經元病損的癥狀和體征。
在1994年的診斷標準中尚有可疑ALS（suspect ALS）。表現為廣泛的下運動神經元損害，而沒有上運動神經元受損的證據，即單純下運動神經元受損。后來研究發現，這一部分病人真正轉化為ALS的不到10%。于是，1998年修訂的ElEscorial標準去掉了該等級。在診斷ALS時必須有上運動神經元的損害，否則誤診的機會較大，而誤診會給病人帶來很多不必要的損害。
3、下列支持ALS的診斷：
（1）1處或多處肌束震顫；
（2）肌電圖提示神經源性損害；
（3）運動和感覺神經傳導速度正常，但遠端運動傳導潛伏期可以延長，波幅低；
（4）無傳導阻滯。
4、ALS不應有下列癥狀和體征：
（1）感覺障礙體征；
（2）明顯括約肌功能障礙；
（3）視覺和眼肌運動障礙；
（4）自主神經功能障礙；
（5）錐體外系疾病的癥狀和體征；
（6）Alzheimer病的癥狀和體征；
（7）可由其他疾病解釋的類ALS綜合征癥狀和體征。
上述診斷標準有助于臨床診斷ALS，但需注意的是，該標準的制定是基于研究及臨床藥物試驗而非臨床實踐，因而標準較為嚴格，不利于疾病的早期診斷。在臨床工作中，應注意將ALS與一些其他病因引起的疾病相鑒別，特別是一些可治性疾病，爭取最大限度地讓患者受益。