近期《自然》期刊系列中發揮關鍵作用的賽默飛質譜儀

發布時間：2012-01-16 11:26 原文鏈接：近期《自然》期刊系列中發揮關鍵作用的賽默飛質譜儀

　　　【導語】在2011年10-11月期間，在一級科學刊物Nature和Nature Methods上有14篇科研論文使用賽默飛世爾LTQ-Orbitrap或TSQ質譜儀產生數據，聚焦的主題包括：目標物發現與定量研究，Top-down蛋白質組研究繪制蛋白質異構體，同位素標簽方法的精度，提高糖蛋白質組的鑒定產率，基因沉默引起的核酸內切酶活性研究，真菌效應器引起的代謝變化，細胞凋亡研究等。下面請小編帶您概覽一下這些文獻及其創新之處，作為對2012新年的獻禮，希望對您的研究工作有所啟發，也希望您的工作可以更快地更多地發表在這些top journal上……

在2011年10-11月其間，在一級科學刊物Nature和Nature Methods上有14篇科研論文使用賽默飛世爾LTQ-Orbitrap或TSQ質譜儀產生數據。這14篇科研論文的主題包括：目標物發現與定量研究，Top-down蛋白質組研究繪制蛋白質異構體，同位素標簽方法的精度，提高糖蛋白質組的鑒定產率（Steentoft等），基因沉默引起的核酸內切酶活性研究，真菌效應器引起的代謝變化，細胞凋亡研究等。

整個科學界都知道，在《自然》期刊上發表文章是非常著名的，這些文章往往是被高引用的文章，這可能會導致促銷、基金資助等，并得到主流媒體的關注。在現代歷史上多次最重大的科學突破都被首次刊登在《自然》上。大多數期刊往往是專門化的，而《自然》往往跨越不同領域，因此其審核的標準是非常嚴格的。《自然》的確是排名第一的期刊，從事研究的科學家們是該期刊的主要讀者，而它的摘要和伴隨摘要的文章往往是最重要的文獻，并可被其它領域的科學家們和受過教育的廣大公眾很好地理解。

　　下面我們就來一睹為快：

　　1、Rapid empirical discovery of optimal peptides for targeted proteomics

　　 基于實驗快速發現適合用于目標蛋白質組學定量的最佳肽段　　

A.B. Stergachis et al. Nature Methods. 2011 Nov 6;8(12):1041-3. doi: 10.1038/nmeth.

　　問題：如何選擇最優化的酶解肽段，既可以容易地被質譜檢測，又具有目標蛋白質定量需要的特征碎裂方式

　　儀器：TSQ Vantage三重四極桿質譜儀，LTQ Velos雙壓線性離子阱質譜儀

　　解決方法：作者報道了一種可規模化、經濟的方法，基于實驗基礎來產生合適的且具有好的碎裂方式的酶解肽段。比起依靠不完善的譜圖數據庫、理論預測算法、合成肽段，或購買全序列蛋白質，作者收集標簽cDNA克隆體來體外合成全序列蛋白質，再用trypsin酶解和MS進行SRM分析。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：體外合成全序列蛋白質采用Thermo Scientific旗下品牌Pierce的人類體外蛋白質表達kit。用于絕對定量的重標肽段購于Thermo。SRM方法建立由Skyline軟件完成但也可以用Thermo的Pinpoint軟件完成。用Q Exactive也可以，和該文中TSQ Vantage一樣，進行方法建立和重組蛋白分析。

　　2、MS³ eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics

　　 MS³減少同位素標記定量蛋白質組學實驗中的比率失真

　　L. Ting et al. Nature Methods. 2011 Oct 2;8(11):937-40. doi: 10.1038/nmeth.1714.1770.　　

　　問題：同位素標記實驗中，選擇用來碎裂的母離子會影響數據的準確度和精確度，目標離子附近的同位素離子峰會被同時選擇和碎裂，影響報告離子強度的準確性。

　　儀器：LTQ Orbitrap Velos

　　解決方法：作者選擇MS³代替MS²來進行定量和鑒定，從而消除MS2中被選擇的母離子被具有相似m/z值得離子干擾。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：要能使用MS³消除報告子比率失真，需要LTQ-Orbitrap的MSⁿ功能。最新的Orbitrap Elite具有更快的掃描速度，可以提供更多的肽段/蛋白質鑒定和定量。

　　3、Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging

　　氣相純化帶來準確、多通道的同位素標簽蛋白質定量

　　C. Wenger et al. Nature Methods. 2011 Oct 2;8(11):933-5. doi: 10.1038/nmeth.1716.　　

　　問題：同位素標記定量中定量數據的準確性和精確性

　　儀器：LTQ Orbitrap Velos ETD

　　方法：介紹了一種新方法叫做“QuantMode”：選取母離子，用ETD的陰離子碰撞使其價態減小，假設之前被一起選中的（“co-selected”）具有相同m/z的干擾離子具有不同的價態，在價態減小之后，目標離子和干擾離子的m/z不再相同，可以被更精確地選取出來。

　　選取出的價態減小的離子用HCD裂解，同樣的母離子再次用離子阱的CID裂解，結果產生了經過對同一目離子優化碰撞能后的兩個系列的碎片離子。HCD裂解含有不受影響的報告子，CID給出離子序列信息，這兩組離子用C trap收集后一起送入Orbitrap分析，優點在可以提高測量的準確性。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：需要用ETD技術來獲取價態減小的離子。

　　4、Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics

　　 Top-Down蛋白質組學繪制完整蛋白質異構體

　　J. Tran et al. Nature. 2011 Oct 30;480(7376):254-8. doi: 10.1038/nature10575.　　

　　問題：提高自上而下（top-down）蛋白質組學有限的覆蓋率

　　儀器：Orbitrap Elite和LTQ FT

　　方法：用四維分析（二維電泳，LC和MS）鑒定人類細胞中1043個基因產物，這些產物又因為翻譯后修飾（PTMs），RNA 剪切（splicing）和水解而衍生為3000多種蛋白質。整個系統的分離能力和蛋白質覆蓋率提高了20多倍。該研究代表了迄今為止top-down質譜法在提高蛋白質組覆蓋率方面的最高水平。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：Orbitrap Elite提高的分辨率和更快的掃描速度可配合LC做Top down分析。各種裂解方式結合（HCD，CID和ETD）提高序列覆蓋率，從而鑒定和區分蛋白質異構體。

　　5、Mining the O-glycoproteome using zinc-finger nuclease–glycoengineered SimpleCell lines

　　 利用鋅指核酸酶-糖化設計的簡單細胞系來挖掘O-糖蛋白質組

C. Steentoft et al. Nature. 2011 Oct 30;480(7376):254-8. doi: 10.1038/nature10575.　　

　　問題：基于RNAi的基因沉默技術還未被證明對細胞的糖基化工程（glycoengineering）有效，可能是因為在內質網（ER）-高爾基體膜積累中糖基轉移酶發揮作用，減慢了轉化。

　　儀器：LTQ Orbitrap XL ETD

　　方法：基于鋅指核酸酶（ZFN）的基因打靶技術是一種獨特的工具，可高特異性地使基因變異。作者使用COSMC（b1,3-GT的重要的特異性蛋白伴侶）的ZFN基因打靶，對穩定的、帶有簡單O－糖基化的人類細胞株進行糖基工程化改造，顯示只有截斷的Tn和STn O -聚糖，被稱為“SimpleCell'系（簡單細胞系）。

　　簡單細胞系使作者使用修飾后的LWAC 凝集素色譜柱和nLC-MS/MS（納升液相色譜-串聯質譜）技術，來研究人類細胞的O-糖基化蛋白質組，發現了許多O-糖蛋白和糖基化位點，包括以前未被鑒定過的酪氨酸殘基連接位點。作者鑒定了100多個O-糖蛋白和350多個糖基化位點（很多是以前從未報道過的），包括一個酪氨酸殘基的GalNAc O-聚糖連接位點。文章中強調了用ETD技術鑒定糖肽，以及用HR/AM技術監測糖鏈水合氫離子這兩種功能的重要性。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：多種裂解技術（HCD和ETD）對于表征完整糖肽的重要性。用HCD來鑒定糖鏈結構/組成，ETD鑒定肽段序列和糖基化位點。只有賽默飛儀器才能實現的HCD-PD-ETD策略可以提高duty cycle和動態范圍，比交替的數據采集方法，HCD-PD-ETD可鑒定出更多的O-糖肽。

　　相關名詞釋義：

　　基因打靶技術(Gene targeting technology)：是指通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因為目的的一項技術。

　　COSMC：核心I b3-半乳糖基轉移酶特異性分子伴侶，COSMC是 b1,3-GT的重要的特異性蛋白伴侶。

　　cell line 細胞系：可以在試驗室培養的、可以儲存的純化的具有某些特定基因特征的細胞。

　　6、The endonuclease activity of Mili fuels piRNA amplification that silences LINE1 elements

　　Mili核酸內切酶的活性刺激piRNA的擴增，沉默LINE1元素

　　S. De Fazio et al. Nature. 2011 Oct 23;480(7376):259-63. doi: 10.1038/nature10547.

　　問題：研究Piwi催化的內切核苷酸的活性

　　儀器：LTQ Orbitrap Velos

　　方法：基因工程方法。為研究Piwi催化的內切核苷酸的活性，作者在小鼠上設計了突變點，在DDH催化Mili和Miwi2的實驗中，將第二個天冬氨酸取代為丙氨酸，分別產生Mili^DAH和Miwi2^DAH等位基因。分析來源于純合Mili^DAH胎兒配子母細胞的Mili鍵合的piRNAs，顯示轉位子piRNA擴增失敗，導致在Miwi2核糖核酸微粒中連接的piRNA的標記還原。本文用質譜來分析野生型和Mili^DAH P10 睪丸中的Mili復合物，從而幫助研究這些過程。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：LTQ Orbitrap Velos的HR/AM和快速的MS/MS數據采集，幫助獲得更高的蛋白序列覆蓋率和更多的肽段鑒定數。另外，LTQ Orbitrap Velos的深入挖掘能力，還可從含有角蛋白，胰酶和免疫球蛋白這些高豐度干擾物的樣品中發現低豐度的蛋白。

　　對該文獻相關的報道：

　　Nature：Piwi蛋白在轉位子沉默中的作用

　　近日，國際著名雜志Nature刊登了意大利研究者的最新研究成果“The endonuclease activity of Mili fuels piRNA amplification that silences LINE1 elements。”

　　Piwi蛋白與同它們相關的“Piwi相互作用RNA”（piRNA）的組合，調控動物生殖細胞系中的“外成轉位子沉默作用”。Piwi蛋白被預測是核酸內切酶，但這種活性的重要性過去卻未在活體中演示過。現在，Dónal O\'Carroll 和 Ramesh Pillai的實驗室已培育出了小鼠模型，在其中，預計對在小鼠的三個Piwi蛋白Mili、Miwi 和 Miwi2中的核酸酶活性至關重要的殘體都發生了突變。突變的小鼠表現出表現型差異。Mili 和 Miwi突變體在piRNA生成、轉位子沉默作用和繁殖力方面是有缺陷的，而Miwi2突變體則有正常的piRNA水平，似乎在進行piRNA放大，并且使轉位子沉默。這些研究凸顯了負責piRNA生物生成的鼠科動物的各種酶之間的差別。

　　7、Cascades of multisite phosphorylation control Sic1 destruction at the onset of S phase

S期多磷酸化位點控制的Sic1降解

　　M. Koivomagi et al. Nature. 2011 Oct 12;480(7375):128-31. doi: 10.1038/nature10560.

　　問題：研究Sic1多磷酸化位點機理

　　儀器：LTQ Orbitrap

　　方法：通過精確的導向對接相互作用（在Sic1和Cks1中特定細胞周期對接的生物序列）可形成多磷酸化過程的路線。該研究中用質譜定量研究Cks1的T48磷酸化。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：具有多種裂解方式（HCD，CID，ETD）的IT-Orbitrap，可以全面地鑒定磷酸化肽段和磷酸化位點，特別是在Orbitrap上可以采用數據相關自動多級碎裂樹（data dependent decision tree, DDDT）的方法。

　　8、Metabolic priming by a secreted fungal effector

　　由分泌的真菌效應器引起的代謝變化

　　A. Djamei et al. Nature. 2011 Oct 5;478(7369):395-8. doi: 10.1038/nature10454.

　　問題：研究 U. maydis分泌的分支酸變位酶Cmu1為致病因子

　　儀器：LTQ FT

　　方法：研究被玉米黑粉菌（U. maydis）菌株感染的玉米細胞間隙液蛋白質組，發現植物克隆/定植過程中Cmu1的分泌。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：HR/AM和快速MS/MS數據采集幫助獲得更高的蛋白序列覆蓋率和更多的肽段鑒定數。可用Orbitrap提高性能。

　　9、Saccharomyces cerevisiae THI4p is a suicide thiamine thiazole synthase

　　 釀酒酵母THI4p是一種自殺性硫胺噻唑合酶

　　A. Chatterjee et al. Nature. 2011 Oct 26;478(7370):542-6. doi: 10.1038/nature10503.　　

　　問題：制備具有活性的重組野生型THI4p，這種基因產物參與真核細胞中噻唑的生物合成，并且證明THI4p為僅存在單個周期的自殺性酶。

　　儀器：LTQ FT

　　方法：MS用于測定由大腸桿菌表達的重組野生型THI4p的初始分子量，比理論分子量低34Da。而未與代謝物結合且無任何活性的THI4p8的活性位點突變體并沒有被修飾，表明34Da的質量丟失在某種程度上和蛋白的催化活性有關。為了定位這個修飾位點，修飾的wtTHI4p用胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）酶解后用MALDI和FT-MS分析肽段碎片。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：HR/AM可測定精確分子量，也可鑒定肽段序列和定位PTMs。這些實驗在IT-Orbitrap上更容易被實現，可利用多種裂解方式獲得更高的肽段覆蓋率和更多的PTMs位點。

　　10、Global profiling of dynamic protein palmitoylation

　　 全面分析動態的蛋白質棕櫚酰化

　　B. R. Martin et al. Nature Methods. 2011 Nov 6;9(1):84-9. doi: 10.1038/nmeth.1769.　　

　　問題：研究棕櫚酰化的動態調控

　　儀器：LTQ Orbitrap Velos

　　方法：結合17-ODYA代謝物標記，SILAC標記和MS準確鑒定和定量富集的棕櫚酰化蛋白質。在鼠T-cell hybridoma cells里鑒定和定量了400多種棕櫚酰化蛋白。通過17-ODYA代謝脈沖追蹤標記，可區分快速轉化和固定修飾的棕櫚酰化蛋白。最后利用特異性脂肪酶抑制因子，發現一組特別的酶調節的棕櫚酰化蛋白。這些發現從大量蛋白質棕櫚酰化中，區分出了一批特別的由水解酶動態調節的棕櫚酰化蛋白。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：超高分辨率，如Orbitrap提供的>100,000的分辨率對于SILAC實驗的精確鑒定和定量是必須的。

　　11、S-nitrosylation of NADPH oxidase regulates cell death in plant immunity

　　 NADPH氧化酶的S-亞硝基化調節植物免疫中的細胞凋亡

　　B. Yun et al. Nature. 2011 Oct 13;478(7368):264-8.

　　問題：研究NADPH氧化酶是否可能發生S-亞硝基化

　　儀器：LTQ Orbitrap XL

　　方法：MS分析結果和Cys 890的S-亞硝基化結構一致。這些研究結果總體表明，AtRBOHD特別是在S-890體外S-亞硝基化。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：Orbitrap超高的質量準確度和高分辨，可以獲得可信的序列結果。

　　12、Molecular mechanism of anaerobic ammonium oxidation

　　 厭氧氨氧化菌的分子機制

　　B. Kartal et al. Nature. 2011 Oct 2;479(7371):127-30. doi: 10.1038/nature10453

　　問題：研究厭氧脫氮機制相關的基因和蛋白，純化可催化N₂H₄合成和氧化為N₂的關鍵酶。

　　儀器：LTQ FT

　　方法：蛋白質組學方法

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：HR/AM和快速MS/MS數據采集幫助獲得更高的蛋白序列覆蓋率和更多的肽段鑒定數。可用IT-Orbitrap鑒定更多肽段和蛋白。

　　13、A heteromeric Texas coral snake toxin targets acid-sensing ion channels to produce pain

　　 異聚德克薩斯州銀環蛇毒素作用于酸敏感的離子通道產生疼痛感

　　C. J. Bohlen et al. Nature. 2011 Nov 16;479(7373):410-4. doi: 10.1038/nature10607　　

　　問題：鑒定蛇毒液可激活軀體感覺神經元

　　儀器：LTQ Orbitrap

　　方法：毒液中主要活性成分為MitTx-a和MitTx-b。質譜用于鑒定這些是否為蛋白質。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：超高質量準確度和高分辨可以獲得可信的序列結果。

　　14、Evolution of a new enzyme for carbon disulphide conversion by an acidothermophilic archaeon

　　一種嗜酸硫氧化細菌中一個新的二硫化碳轉化酶的演變

　　M. J. Smeulders et al. Nature. 2011 Oct 19;478(7369):412-6. doi: 10.1038/nature10464.

　　問題：找到Acidianus A1-3的CS2水解酶的結構，可能機制和演變過程

　　儀器：LTQ FT

　　方法：Acidianus A1-3細胞的CS2轉化酶（亞基分子量24kDa）是CS2水解酶。用LTQ FT鑒定CS2水解酶序列證明CS2水解酶是否由Acidianus A1-3細胞純化。

　　選擇的或可供選擇的賽默飛產品：LTQ FT的HR/AM可得到高序列覆蓋率。這些實驗也可在IT-Orbitrap上實現，獲得更高的覆蓋率。

長期以來，賽默飛世爾科技質譜產品以其卓越的技術性能與持續的創新精神，深受專業用戶的青睞，也當之無愧地成為幫助科研工作者獲取尖端成果的利器神兵。這十四篇Nature文章就是又一力證。

　【附錄】

　　名詞解釋：

　　HR/AM：高分辨率/精確質量

　　HCD：高能誘導解離

　　CID：碰撞誘導解離

　　ETD：電子轉移解離

　　LTQ Orbitrap系列的工作原理：

　　LTQ Orbitrap是整合了線性離子阱質譜儀和軌道阱質量分析器的組合式高分辨質譜儀系統。大氣壓離子源處產生的離子在LTQ質量分析器被捕獲。而一旦處于離子阱中，這些離子就可以通過LTQ的MS或MSn 等掃描模式進行分析。或者---離子從LTQ軸向排出，進入一個C-形離子阱(C-trap)，再經過C-trap進入Orbitrap質量分析器。通過快速增加Orbitrap中心電極的電壓可將C-trap來的離子捕獲，捕獲的離子圍繞中心電極做環形運動并沿中心電極軸向振動。

　　來自軌道阱外電極的信號經過放大后，通過快速傅立葉變換得到頻譜,而頻率最終被轉換成質譜圖。另外LTQ Orbitrap還有一個新型碰撞池能夠提供額外的二級質譜實驗。離子被選擇性的保留在線性離子阱中，可以通過離子阱碰撞誘導解離(CID)或者新型高能誘導斷裂(HCD)。高能碰撞誘導解離離子經過C-trap到達充滿氣體的碰撞池。高能誘導解離的二級質譜實驗中，標準化的碰撞能量可以在不同的儀器之間提供重復的數據。