一、原理
二硝基氟苯（DNFB）是一種半抗原，將其稀釋液涂抹腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結合成完全抗原，由此刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。4～7天后再將其涂抹于耳部，使局部產生遲發型變態反應。一般在抗原攻擊后24～48h達高峰，故于此時測定其腫脹程度。
二、材料
DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器。
三、實驗步驟
1、試劑配制
DNFB溶液 DNFB溶液應新鮮配制，稱取DNFB50mg，置清潔干燥小瓶中，將預先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封。混勻后，用250μL注射器通過瓶蓋取用。
2、致敏
每鼠腹部皮膚用硫化鋇脫毛，范圍約3cm×3cm、用DNFB 溶液50μL均勻涂抹致敏。
3、DTH的產生與測定
5天后，用DNFB 溶液10μL 均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。攻擊后24h 頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mm的耳片，稱重。
四、數據處理與結果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F值<
F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。
左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的差值顯著高于與對照組的差值，可判定該項實驗結果陽性。
五、注意事項
操作時應避免DNFB與皮膚接觸。