注意事項
1．在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；
2． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照；
3．內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；
4． PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定；
5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。
其 他
1．反轉錄酶的選擇
（1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃；
（2）禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃；
（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn2+存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構；
（4）MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體：商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。
2．合成cDNA引物的選擇
（1）
隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。
（2）
Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。
（3）特異性引物：最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。