逆轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）

實驗概要

提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

a、反轉錄酶的選擇

1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

2、禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。

4、MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

b、合成cDNA引物的選擇

1、隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2、Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A  )尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A  )RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。

3、特異性引物：最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。

主要試劑

1．RNA提取試劑

2．第一鏈cDNA合成試劑盒

3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

4．Taq DNA聚合酶

實驗步驟

1. 總RNA的提取：見相關內容。

2.   cDNA第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM  Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。

（1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。

（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列試劑的混合物：

   10×PCR buffer   2μl

   25mM MgCl2     2μl

   10mM dNTPmix   1μl

   0.1M DTT       2μl

   輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加熱15min以終止反應。

（5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存備用。

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：

   第一鏈cDNA          2μl

   上游引物（10pM）    2μl

   下游引物（10pM）    2μl

   dNTP(2mM)           4μl

   10×PCR buffer         5μl

   Taq 酶（2u/μl）       1μl

（2）加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。輕輕混勻，離心。

（3）設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。

（4）電泳鑒定：進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

（5）密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

注意事項

（1）、在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。

（2）、為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

（3）、內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

（4）、PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。

（5）、防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA樣品，在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。