①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為賴氨酸的tRNA，在引物tRNA 3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。
②RNase H活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA 5'端水解掉RNA分子。
③DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。除此之外，有些逆轉錄酶還有DNA內切酶活性，這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。
逆轉錄酶的發現對于遺傳工程技術起了很大的推動作用，它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA并以它為模板，在逆轉錄酶的作用下，合成出互補的cDNA，由此可構建出cDNA文庫（cDNA library），從中篩選特異的目的基因，這是在基因工程技術中最常用的獲得目的基因的方法。