預變性
破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構。使DNA充分變性，減少DNA復雜結構對擴增的影響，以利于引物更好的和模板結合，特別是對于基因組來源的DNA模板，最好不要吝嗇這個步驟。此外，在一些使用熱啟動Taq酶的反應中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應得以順利進行。
三種循環
①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。
延伸時間原因
用PCR儀擴增時，變性-退火-延伸循環完成后，繼續72度延伸了10分鐘的原因：
1、延伸時間取決于待擴增DNA片段的長度，當然是在反應體系一定的條件下。例如，使用TaqDNA聚合酶，72度時的堿基摻入率為35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。
2、根據延伸速率推得，擴增1kb以內的DNA片段1min即可，而3-4kb則需要3-4min，依次照推。通常在最后一輪要適當的將延伸時間延長至4-10min，這樣做是使PCR反應完全以提高擴增產量。
3、繼續72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應完全以提高擴增產量外，還有一個作用是：在用普通Taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進行。
PCR引物的選擇
對靶序列中潛在的引物位點進行分析， 這些位點應該不會形成同源多聚體結構，也沒有明顯的形成二級結構的趨勢，不會自身互補，與基因組中的其他序列無顯著的同源性。
（1）依據寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公式計算各引物的熔解溫度。
（2）選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似，將產生一種大小和堿基組成合適的產物。兩條引物與所擴增片段的GC含量都應在40%-60%之間。
（3）對寡核苷酸的長度和/或位置進行細調。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無明顯的互補性。作為一條經驗性的規律，一條引物上不該含有三個連續的與另一條引物互補的核苷酸。