逆轉錄PCR的實驗

 一、實驗器具與材料：

1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭：1ml、200μl、20μl
3、勻漿管：5ml
4、吸頭臺：放置1ml吸頭的一個，放置20μl吸頭的一個
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、試劑瓶：2個60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）；1個125ml的白色試劑瓶（放無水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、試管架：5ml、1.5ml、20μl
10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個備用，一個裝無水乙醇，另一個裝DEPC水
11、鋁制飯盒：4個
12、塑料小飯盒：1個
13、大瓷缸：2個
14、錫泊紙：一卷
15、卷紙：2卷
16、三角燒瓶：帶蓋，稍大

二、實驗器具的處理與準備

1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干）
3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）

三、試劑配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。
2、75%乙醇：用無水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）
3、異丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、瓊脂糖

四、幾種緩沖液的配制：

1、電泳緩沖液：
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE （貯存液）
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液 450ml水--→500ml工作緩沖液

2、上樣緩沖液：
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青FF
30%甘油
6×緩沖液，4℃保存

五、瓊脂糖凝膠的配制：
1、1.0%： 1.0g瓊脂糖 100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現進行電泳。
2、1.5%： 同上，將瓊脂糖的量改為1.5g

六、需購置的Rt-PCR材料：
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo（dT）15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega （Buffer）
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00

七、引物合成

1. 正義：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反義：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、par-4:
正義：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反義：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火溫度計算
2（A T） 4（G C）
正反義平均數，再上下波動度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好
5、引物稀釋：
加DEPC水量為（μl）= ? nmol / OD × 管上所標OD數×100
是為10p mol / μl 濃度的引物溶液

八、PCR產物電泳
先將1-10μl左右PCR產物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸打混勻后進行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結果掃描打印。

九、幾個注意點：
1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴。
2、Rt時，先打開PCR預熱30分鐘。
3、RNA抽提前，打開離心機預冷。