（一）RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產物。 | |
可能原因 | 解決方案 |
RNA被降解 | 在用來驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA。 使用良好的無污染技術分離RNA。 在將組織從動物體取出后立刻處理。 |
RNA中包含逆轉錄抑制劑 | 通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70%（體積分數）乙醇對RNA沉淀進行清洗。可以加入糖元（0.25μg/μL到0.4μg/μL）以幫助小量樣品RNA的恢復。 逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，亞精胺，甲酰胺和胍鹽。 將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應比較產量以檢驗抑制劑。 |
用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒有很好退火 | 確定退火溫度適合您的引物。對于隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在25℃保溫10min。 對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo（dT）或隨機六聚體確定GSP是反義序列。 |
起始RNA量不夠 | 增加RNA量。 |
RNA模板二級結構太多 | 將RNA和引物在不含鹽及緩沖液的條件下變性/退火。 提高逆轉錄反應溫度。 注意：不要在＞60℃時使用oligo（dT）引物，選擇一個在反應溫度可以退火的GSP。 對于＞1kb的RT-PCR產物，保持反應溫度≤65℃。 |
（二）RT-PCR特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預期條帶。 | |
可能原因 | 解決方案 |
富含G+C的模板 | 對于G+C含量＞50%的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 |
鎂離子濃度太低 | 從1mmol/L到3mmol/L，間隔0.5mmol/L進行一系列反應，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。 |
引物和模板非特異性退火 | 在第一鏈合成中使用GSP，而不是隨機引物或oligo（dT）。試用允許高溫cDNA合成的GSP。 |
RNA中沾染了基因組DNA | 使用擴增級DNaseⅠ處理RNA。使用沒有逆轉錄的對照反應檢測DNA污染。 |
（三）PCR忠實性：PCR在產物序列中引入了錯誤。 | |
可能原因 | 解決方案 |
聚合酶忠實性低 | 使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶。 |
循環數太多 | 降低循環數。 |