選擇多種限制性內切酶的基本準則

是選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA的酶。

裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游或下游區，而不裂解核心區的酶則使兩側序列都擴增。

Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適于環化及反向PCR的片段的末端片段。